脑缺血再灌注损伤中自由基与锌离子的相互作用

房亚兰 尹 洁 刘克建 赵咏梅

(首都医科大学宣武医院 北京市老年病医疗研究中心 神经变性病教育部重点实验室，脑血管病转化医学北京市重点实验室，北京 100053)

脑缺血后再灌注可挽救濒临死亡的细胞，使某些可逆性损伤获得功能上的恢复。但缺血后的血流恢复能进一步导致组织损伤和功能障碍，称为缺血再灌注损伤。降低再灌注损伤被认为是治疗缺血性脑卒中的关键。近年来的研究[1-2]表明，脑缺血再灌注不但诱导大量的自由基产生，引发氧化应激，而且引起细胞内锌离子(Zn2+)大量聚集。本文拟对脑缺血再灌注损伤过程中自由基与Zn2+的相互关系进行阐述。

1 脑缺血再灌注时自由基的产生途径及损伤机制

最近的研究[8]表明，再灌注24 h内，在大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠的半暗带区内ROS随再灌注时间延长递增，且ROS量与脑梗死体积比率呈正相关。给予MCAO大鼠线粒体ROS抑制剂，可显著降低大鼠再灌注后6 h脑内ROS的产生，减少脑梗死体积，说明ROS在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用[9]。研究[10]显示，缺血后锥体神经元内自由基的产生与线粒体通透性改变相关。线粒体通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)开放引起促凋亡蛋白释放，例如凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)和细胞色素C，后者可激活Caspase-9，进而激活Caspase-3，引起细胞凋亡[10]。因此，脑缺血后，自由基可通过引发细胞凋亡途径参与神经细胞的损伤过程。

2 脑缺血再灌注后脑组织内Zn2+的变化及作用

锌元素是体内必需的微量元素之一，但过量的锌有细胞毒性，导致细胞凋亡。生理条件下，Zn2+和谷氨酸一起储存在神经元的突触囊泡中，受到刺激时，Zn2+释放入突触间隙，作用于突触后的锌结合位点[11]。此外，金属硫蛋白(metallothionein, MT)结合大量的Zn2+，其中MT3对于保持神经元中的锌稳态有重要作用[12]。Zn2+也聚集于线粒体基质中，线粒体内的Zn2+流可通过去极化以及mPTP的开放导致胞质内Zn2+水平增加[13]。除此之外，胞内其他结合位点也可能释放Zn2+，调控缺血后Zn2+水平的病理性上升。研究[2]表明，MCAO大鼠脑梗死半暗带区域内，Zn2+阳性细胞数目在再灌注24 h内递增，且Zn2+阳性细胞数目与脑梗死体积比率呈正相关，说明Zn2+参与脑缺血再灌注损伤。

笔者的研究[2]表明，MCAO大鼠脑内半暗带区Zn2+与凋亡神经元共定位。应用特异性锌离子螯合剂N，N，N′,N′-4(2-吡啶甲基)乙二胺[N，N，N′,N′-tetrakis(2-pyridylmethyl) ethylenediamine, TPEN]显著减少缺血大鼠脑半暗带区Zn2+与凋亡神经元数目，减小脑梗死体积，改善神经功能，且这种保护作用可持续至再灌注后的第14天，首次证明Zn2+在脑缺血损伤中有重要作用[2]。笔者的研究[14]还显示，过量的锌积累于缺血大鼠的微血管，TPEN显著改善缺血大鼠脑内微血管的通透性，说明锌释放和积累导致脑缺血后的血-脑脊液屏障损害。

缺血后Zn2+对神经元线粒体的作用机制十分复杂。Zn2+可抑制线粒体的电子传递，不可逆地阻断重要的线粒体基质酶，进而导致mPTP激活[13]。缺血条件下，内源性Zn2+与线粒体功能紊乱密切相关。锌离子螯合剂可减少缺血起始阶段线粒体细胞色素C释放，抑制Caspase 3激活。亚微摩尔浓度的Zn2+可同时引起线粒体内膜多个离子通道激活以及mPTP开放[15]，引起凋亡。

除了影响线粒体功能外，Zn2+也参与调节细胞的其他代谢过程。如在缺血条件下，Zn2+调节AMPA通道、红藻氨酸通道(Ca-A/K通道)GluR2亚基表达，增加Ca-A/K通道对钙离子(Ca2+)的通透性[16]。Zn2+也可以通过激活膜上MAPKs家族介导神经元损伤[17]。然而另有研究[18]表明，Zn2+调控转录因子表达是预适应的保护机制之一。以上关于锌离子在脑缺血再灌注损伤中的相关研究，说明锌离子是一个非常关键的靶点，具有重要的研究意义和广阔的应用前景。

3 Zn2+与自由基引发的氧化应激损伤之间的相关性

Zn2+和ROS在缺氧缺血性应激过程中积累，并在病理过程中起重要作用。Zn2+是一种潜在的有毒阳离子，参与脑缺血、癫痫和脑外伤中的神经元损伤。一方面，Zn2+发挥其神经毒性的机制包括导致线粒体和线粒体外产生活性氧簇，以及破坏代谢酶的活性，最终导致凋亡和/或坏死过程的激活。各种针对Zn2+毒性的神经保护措施能够降低Zn2+引起的ROS生成。另一方面，细胞内Zn2+稳态对病理生理环境变化敏感，如氧化应激、酸中毒或炎性反应。抗氧化剂能够减弱Zn2+的神经毒性，这些都证明Zn2+与氧化应激损伤之间密切相关。

4 脑缺血再灌注过程中Zn2+对氧化应激的调控作用

近年来，脑缺血再灌注后Zn2+对氧化应激的影响受到关注。文献[19-25]报道，Zn2+可促进自由基产生，引起氧化应激损伤。本课题组的研究[19]显示，锌超载导致缺血神经元线粒体功能障碍。细胞内升高的Zn2+可通过线粒体内级联反应促使ROS生成。有研究[20]表明，脑缺血时线粒体对Zn2+的摄取增加，线粒体内快速大量聚集的Zn2+通过抑制电子传递链的复合体Ⅲ的激活或干扰复合体Ⅰ和α-酮戊二酸脱氢酶促使大量的ROS产生，ROS能够引起线粒体膜电位变化，使线粒体功能丧失。尽管Zn2+与Ca2+都可引起上述变化，然而与Ca2+相比，由Zn2+介导的线粒体功能失调的作用更为强烈[20]。

Zn2+升高后也可通过非线粒体途径引发Zn2+依赖性的氧化应激反应。在培养的神经元中，Zn2+可以激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)，进而导致NADPH氧化酶激活，促使NOS生成，同时ROS、NO会相应增加[21]。另一种可能方式是通过nNOS介导，由于局灶性脑缺血时nNOS阳性神经元增加，此途径可能参与了脑缺血损伤[22]。

Zn2+通过线粒体损伤或NADPH氧化酶激活引起氧化应激反应，进而促进ROS产生，诱导DNA链断裂，导致DNA修复酶-多聚核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase, PARP]激活。过量的PARP通过以NAD+作底物催化蛋白质的多聚(ADP-核糖基)化，导致NAD+大量消耗、糖代谢障碍、ATP缺失。应用NADPH氧化酶、NOS或PARP的阻断剂均可抑制Zn2+破坏神经元[23]。PARP激活诱导线粒体释放AIF，促进AIF转入核内，引起非Caspase依赖的DNA断裂及细胞死亡。此外，PAR(PARP的多聚体产物)可以直接诱导AIF释放[26]。体内研究[2]表明，脑缺血导致PARP-1的裂解和激活，而螯合Zn2+后PARP-1的裂解和激活都降低，说明Zn2+参与PARP-1的裂解和激活，促进神经细胞死亡。

Zn2+也通过溶酶体介导细胞死亡。有研究[27]显示，暴露在H2O2或毒性水平的Zn2+环境时，溶酶体内锌迅速增加，导致膜的完整性破坏，溶酶体释放组织蛋白酶，最终海马区神经元通过锌、组织蛋白酶途径死亡。这些结果显示，锌是氧化应激和溶酶体膜通透性连接的纽带，溶酶体锌超载和溶酶体损坏是神经元氧化应激死亡的关键步骤。

尽管一些研究[20,23]表明，Zn2+可促进氧化应激损伤，但另一些报道[28-29]显示，Zn2+具有抗氧化作用。许多含锌蛋白或被锌调节的蛋白能直接或间接影响细胞的氧化平衡。研究[28]表明，细胞氧化应激损伤与Zn2+下降相关联，Zn2+浓度增加可阻止氧化应激损伤。缺少Zn2+的培养神经元和动物模型氧化信号激活，且通过下调细胞内的谷胱甘肽(glutathione, GSH)降低细胞对促氧化应激物质的承受能力[29]。

5 脑缺血再灌注后氧化应激对Zn2+的调控作用

脑缺血时显著发生的氧化应激和酸中毒能够诱导Zn2+从MT蛋白释放，引起细胞内Zn2+增加，这种机制已经在培养神经元中得到证实，并可能是ZnT3敲除动物海马锥体神经元内Zn2+增加的机制[30]。研究[31]显示，大鼠在含氧量正常但血糖低的情况下，可以引发NO应激，最终引起Zn2+聚集。这可能是通过NMDAR介导的nNOS途径实现的。这种NO依赖性的Zn2+增加可以激活NADPH氧化酶及PARP1，诱导细胞死亡。尽管自由基对锌离子的调控作用已逐渐成为研究热点，但目前有关这方面的研究还十分有限。探究氧化应激对锌离子的调控，必将有助于揭示脑缺血损伤的机制。

综上所述，在脑缺血再灌注损伤中，自由基与Zn2+之间存在相互作用，Zn2+可能通过线粒体或NADPH氧化酶等途径促进ROS产生，ROS也可以促进Zn2+从MT等存储位点释放，两者相互作用促进神经损伤。Zn2+在特定条件下又可以发挥抗氧化作用。但迄今为止，Zn2+促进氧化应激并产生损伤的分子机制还没有完全阐明，ROS对Zn2+的调控作用及机制更是知之甚少。因此，脑缺血再灌注损伤中自由基与Zn2+的相互作用值得深入研究，这将为开发脑缺血损伤的保护措施提供新策略。

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