响应面法优化“金花”菌培养基配方

周国庆，谭玉梅，王亚萍，黄永会，任锡毅，刘永翔，刘作易

(1.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025 ；2.贵州省农业科学院 生物技术研究所，贵州 贵阳 550009；3.贵州省农业生物技术重点实验室，贵州 贵阳 550006；4.贵州省农业科学院，贵州 贵阳 550006)

茯砖茶是我国特有黑茶，属于后发酵茶[1]。茯砖茶具有多元化的保健功能，其中的茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，即黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类及酚酸类中多元酶类及其衍生物的混合物。茶多酚还是一种新型天然抗氧化剂，具有清除自由基、抗衰老等作用[2]；另外对预防心血管疾病效果尤为显著，具有降血压、血脂、血糖等方面的作用[3]。

茯砖茶制造主要步骤包括毛茶制作、毛茶堆放、半成品拼配、气蒸、渥堆、压制成型、发花干燥和切割包装等[4]。其中“发花”是茯砖茶生产制造过程中最独特工艺，发花过程就是“金花”菌产生的过程[5]；“金花”越多，茶叶质量被认为越好，其被作为黑茶品质优劣的重要指标[6-7]。冠突曲霉是发花过程中的优势菌种，也正是它在茶叶发酵过程中产生一系列的代谢产物赋予了茯砖茶各种保健功效。

传统的茯砖茶制作采取的是自然发花，存在发花周期长及产品不稳定的问题，目前大多数茶叶生产企业也都存在发花差，发花参差不齐甚至不发花等问题[8]。研究者们通过研究发现人工接种发酵从发酵周期、功效成分产量、感官评定等各方面都明显优于自然发酵[9]。所以人工接种必定可以改善茯砖茶的品质，然而人工接种所用的培养基制备及优化是解决人工接种的关键性问题。欧阳梅和罗冰[9-10]等人用单因素试验及单水平正交的方法制备的“金花菌”液体培养基都相对比较复杂，不便于制备。本文将优化以麦麸为基础的单菌发酵剂，以发酵剂中产孢量为研究对象，在单因素的实验基础上，应用响应面法对发酵剂的配方进一步优化，以期获得能在较短时间内培养出高孢子浓度的培养基。而这种用料简单，配置方便，经济节约的培养基一定能加速人工接种的推广，同时还为进一步的培养基优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

冠突曲霉：由贵州省农业科学院微生物重点实验室分离于茯砖茶上的“金花菌”，经本实验室鉴定为冠突曲霉( Aspergillus cristatus)。菌株号为GZAAS20.1004。

高渗MYA培养基[11]：麦芽提取物20 g，酵母提取物5 g，蔗糖30 g，NaCl 140 g，琼脂粉12 g，加蒸馏水定容至1000 mL。液体培养基不加琼脂粉，分装，及时灭菌，灭菌条件115℃，15 min。

1.2 仪器

各种规格的移液枪(Eppendorf)、SS-325型高压灭菌锅(日本TomyKogyo公司)、超纯水系统(Purelab公司)、常温冰箱(海尔集团)、-20℃低温冰箱(海尔集团)、BSS300-WEI电子天平(德国赛多利斯)、电热恒温培养箱、超净工作台、制冰机、KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)、TS-2102C摇床等其它小型仪器均为国产仪器。

1.3 方法

1.3.1冠突曲霉的培养及孢子悬浮液制备 将冠突曲霉接种于高渗MYA培养基上，37℃培养7 d，在超净工作台上，用灭菌过的刀片刮取冠突曲霉，放入带有适量玻璃珠的灭菌三角瓶内，每刮取10个平板上的冠突曲霉倒入100 ml无菌水，于摇床上震荡30 min转速设定为150 r/min，再用灭菌过的脱脂棉过滤三角瓶里的菌液，最后对所得滤液利用血球计数板在显微镜下计数；最后保存4℃冰箱备用。

1.3.2发酵液孢子浓度测定方法 无菌环境下向28℃培养了7 d的三角瓶内加100 ml无菌水，震荡摇匀后静置40 min，再利用两层纱布过滤，将滤液倒入灭菌过的放有玻璃珠的三角瓶后放入摇床150 r/min，震荡1 h，将震荡后的溶液利用血球计数板计数。取一块洁净干燥的血球计数板，盖上干净的盖玻片，吸取菌悬液从血球计数板两槽处滴加菌液，待菌悬液浸满计数室，静置5 min后镜检计数[8]。

金花菌孢子数(ml)=N/5×25×104×稀释倍数

采用25×16规格的计数板，N代表5个中方格孢子总数

1.4 实验设计

1.4.1单因素试验 准备500 ml三角瓶若干，利用60目筛子筛去麸皮淀粉末，在各三角瓶内称取10 g麸皮并按照表1添加含水量、NaCl与接种量。表1为单因素试验设计，除考察因素外，其余条件均一致并在28℃条件下培养7 d时，将发酵物浸泡过滤处理后测定孢子含量，初步确定各单因素最佳水平。

1.4.2Box-Behnken设计 结合单因素结果的分析，使用Design Expert中的BBD设计以上3个因素三个水平(共17个试验点，5个中心点)的响应面试验，以发酵剂孢子浓度为响应值[12]。

1.5 统计分析

利用Design Expert软件对实验数据进行多元回归拟合，得到二次多项式，对该方程进行显著性、方差分析并分析响应面试验结果，确定发酵剂最大孢子含量下对应的含水量，氯化钠浓度及接种量[13]。最后用经响应面优化后的发酵条件进行三次验证实验来验证模型预测的准确性。

表1 单因素试验因素水平表Tab.1 Factors and the levels of experiment of single factor experiment

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1含水量对产孢量的影响 由图1可以看出，不同的含水量对产孢量影响比较大，随着含水量的增加，产孢量呈递增趋势，当含水量为10 ml时，产孢量最大，达到1.8×107个/ml，高出5 ml含水量的孢子数2倍多，表明适宜的含水量对培养基起着极其重要的作用。对于含水量超过10 ml时，产孢量突然下降，其原因可能是由于含水量过高致使冠突曲霉的呼吸代谢受阻，抑制了其菌体的生长和产孢能力。

图1 含水量对产孢量的影响Fig.1 Effect of moisture content on sporulation

2.1.2NaCl对发酵剂产孢量的影响 由图2可知，NaCl的添加量对产孢量影响也较大，当NaCl含量达5%的时，产孢量达到最大即2.01×107个/ml。当NaCl添加量高于5%时，产孢量急剧下降，表明NaCl添加量过大对冠突曲霉的产孢量有抑制作用。究其原因可能是NaCl所离解出的Na+和Cl-细胞内外渗透压与电位差有着重要影响，进而使其细胞营养物质运输受影响，产生单盐毒害，致使微生物活性受影响，最后造成产孢量不断减少。此结果和罗冰等人研究结果基本一致[10]。

图2 NaCl浓度对产孢量的影响Fig.2 Effect of NaCl concentration on sporultion

2.1.3接种量对发酵剂产孢量的影响 从图3可以看出，随着接种量的增加，产孢量先呈上升趋势后下降，当接种量为240 μl的时候孢子产量最高达到1.98×107个/ml。其原因可能是由于接种量较低时，孢子基数较少，因此其产孢量低，当接种量增加时，孢子基数较多，使菌体生长提前进入对数期，致使菌体营养代谢加快，从而提高了产孢量；当接种量过大时，孢子基数较多，培养基中的营养物质不能满足微生物的需要，抑制了菌体的生长，因此产孢量呈下降趋势。

图3 接种量对产孢量的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on sporulation

2.2 冠突曲霉单菌发酵剂响应面法优化

2.2.1响应面因素水平的选取 根据Box-Behnken的验设计原理，综合2.1单因素影响试验结果，分别选取含水量(ml)、NaCl(%)以及接种量(μl)三个因素的高中低三个水平，在单因素的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法[12]，试验因素水平见表2。

表2 响应面试验因素及水平Tab.2 Factors and the levels of experiment of Response Surface Analysis

2.2.2响应面分析试验设计及结果 以含水量A、氯化钠浓度 B以及接种量C为自变量，以发酵剂孢子浓度为响应值(Y)，进行响应面分析试验，试验方案及结果见表3。

2.2.3多元二次响应面回归模型的建立及分析 利用Design Expert软件对表3实验数据进行多元回归拟合，得到响应曲面二次多元回归方程：

Y=34.84-1.09A+1.03B+2.73C-0.21AB-0.29AC-0.62BC-13.40A2-18.02B2-8.34C2

各因素的方差分析见表4。

表3 Box-Behnken实验设计方案及结果Tab.3 Box-Behnken design and results

分析表4可知，该模型p<0.0001，失拟项p=0.9721>0.05可知该模型回归极显著，失拟项不显著，不需要引入更高次项系数。模型的复项关系数R2=0.9999，说明该模型的拟合较好，各个因素对响应值的影响不是线性关系，能较好的模拟不同条件下产孢量的预测。校正复项关系数AdjR2=0.9999，信噪比Adeq Precision270.872>4，说明该模型在设计区间内误差小，预测较为准确。

从表4可以看出，影响产孢量的A、B、C三个因素影响水平均达到极显著水平P<0.0001。各因素间的交互作用AB、AC、BC均达到显著水平P<0.05，等高线均接近圆形[14]。其中BC交互作用达到极显著水平P<0.0001见图6，AB及AC的等高线图及响应面图见图4、图5。

表4 回归模型的方差分析Tab.4 Analysis of variance with regression model

注：Pr值是方差齐性检查的结果；“**”表示极显著水平，“*”表示显著水平。

图4 含水量与NaCl对产孢量影响的等高线图和响应面图Fig.4 Response Surface of interrelated influence of NaCl content and sporulation

图5 含水量与接种量对产孢量影响的等高线图和响应面图Fig.5 Response Surface of interrelated influence of moisture content and sporulation

图6 NaCl与接种量对产孢量影响的等高线图和响应面图Fig.6 Response Surface of interrelated influence of inoculation amount and sporulation

2.2.4模型验证 在获得非线性回归模型后，为求得最大产孢量，利用Design expert 8对所得回归拟合方程各自变量求一阶偏导数，求得次方程得到最大产孢量最优条件为A=-0.042、B=0.026、C=0.162换算成实际值为含水量9.79 ml、NaCl 6.13%、接种量246.48 μl，预测的最大产孢量为3.51×107个/ml。

为了验证该模型的准确性和实用性，用经响应面优化后的发酵条件进行三次验证实验，产孢量分别为3.43×107个/ml、3.48×107个/ml、3.37×107个/ml，与预测结果3.51×107个/ml基本一致，表明该模型准确性和实用性高，能较好的预测产孢量。

3 结论与讨论

在单菌发酵剂的制备中，影响发酵剂产孢量的因素很多，这些因素之间并不是孤立的，而是互相有联系的[15]。利用Design expert 8 软件，该软件是一款面向实验设计以及相关分析的软件，可以根据具体要求设计出高效的实验方案，并对实验数据做专业的分析，给出全面的可视的模型以及优化结果[16]。传统的正交设计可以同时考虑几种因素，寻找最佳因素水平组合，但是不能在给出的整个区域内找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，故只能分析离散型数据，且存在试验次数多，精度不够高及预测性不佳等缺点[17-18]。响应面法(RSM)最早是由数学家Box和Wilson于1951年提出来的。利用合理的试验设计方法并通过试验得到数据，采用二次回归方程来拟合因子和响应值之间的函数关系，指导多变量优化问题[19]，其中基于Box-Behnken设计的响应曲面法可以进行因素数在3～7个内的试验；试验次数为15～62次，在因素数相同时比正交试验所需的次数少，对于本试验是一种比较理想的方法。该方法通过响应面图直观的分析了三个因素对于产孢量的影响，同时还可以观察各因素之间的交互作用的影响[20]。

传统的发花工艺是指茶叶在一定的水热条件下，其周围的优势菌种如冠突曲霉大量繁殖，形成胞外酶，这些酶和茶叶中的多酚化合物等成分聚合、分解，与微生物本身一起形成了特殊的色、香、味、形[9]。这种自然发酵的过程固然很美妙，但因为周期长、烘房周转困难、条件难以控制、容易污染、发花不均一等问题导致产品品质难以保证，质量难以提升，大幅限制了很多茶叶公司的发展。

但是这些难题都可以在人工接种发花中找寻到解决的办法。科学家们研究发现人工接种发酵能大幅度缩短发酵的时间，缩短了发花的周期，而且人工接种使用的单菌发酵剂可以保证优势菌的生长，控制并减少杂菌的污染以提高茶叶的饮用安全性。本试验应用响应面设计法优化最佳的培养基成分添加量：含水量9.79 ml、NaCl 6.13%、接种量246.48 μl，得到的最大产孢量约为3.51×107 个/ml。实验结果说明通过响应面分析这种方法来优化冠突曲霉发酵剂的成分，能够使发酵剂孢子含量得到大幅度提高。这种用麸皮为基础制得的单菌发酵剂相较于罗冰和欧阳梅等由察氏培养基优化得到的液体发酵剂，成本更低廉，操作更简便，且本发酵剂产孢量高，易于连续培养，对于人工接种发酵的发酵剂制备及优化研究提供一定的参考。

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