ELISA方法检测猪和羊血清中甲型流感抗体的研究

王中正

摘 要：目的：用ELISA方法检测来自安徽铜陵市、凤阳县及蚌埠市养殖场所采集的91份羊与91份猪的血清中甲型流感阳性抗体，以确定其中阳性血清和其所占总量中的比例。方法：采集的样品在实验室经过冷冻离心机来分离血清，并且用ELISA法对这些血清样品进行检测分析，以此检测猪和羊血清中甲型流感的抗体水平。结果：在91份羊血清样品中检测到3份甲型流感阳性抗体，占血清总数的3.3%；在91份猪血清样品中检测到21份甲型流感阳性抗体，占血清总数的23.1%。结论：说明在安徽地区，甲型流感属部分感染且在猪中的感染率高于羊。

关键词：流感病毒；ELISA试剂盒；血清抗体

中图分类号 S858.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）02-0084-04

Abstract：Objective：Detecting the influenza A antibody in the serum samples which collected from 91 goats and 91 swine in Tongling，Bengbu and Fengyang of Anhui Province with ELISA method，so as to determine the existence and prevalence of positive serum in the total.Methods：Serum samples were collected with centrifuging in the laboratory，and detect the antibody levels of H1N1 flu in swine and goats' serum with ELISA method.Results：3 serum samples were influenza A antibody positive detected from 91 goats serum samples，accounting for 3.3% in the total，while 21 influenza A antibody positive were detected from 91 swine serum samples which account for 23.1%.Conclusion：There was some prevalence of influenza A in Anhui Province，and the positive rate of serum in swine was higher than in goat.

Key words：Influenza virus；ELISA kit；Serum antibody

甲型流感病毒可以感染多種家畜和家禽，曾在世界各地都有发生。2007年，菲律宾布拉干省及邦板牙部分猪场后院发现甲型流感病毒，引起全国“红色警报”[1]；而在我国，1957年2月首次发现于中国贵州西部；1977年5月在我国丹东、鞍山和天津再度发现新甲型（H1N1），2个月后从北向南扩散并迅速传遍全国。甲型流感的不断暴发，已经引起国内外的重视，不少实验对其结构、防治、流行特点等做出研究。流感病毒所致病症的差异是因病毒基因的组成不同所致，根据核蛋白（NP）和基质蛋白（MP）的不同，分为3个类型，即甲、乙、丙型。其中，甲型流感病毒最容易发生变异，其主要是通过空气、唾液等传播，具有传染力强，传播速度快等特点[2]。甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H有15个亚型（H1～H15），N有9个亚型（N1～N9）。其中感染人类的亚型有H1N1、H2N2、H3N2[3]，其他亚型可感染禽类或哺乳动物。

甲型流感病毒对各个年龄、性别和品种的猪、羊都有一定的感染能力，并且有明显的季节性，天气多变的秋末、早春和寒冷的冬季易发生[4]。该病初期突然发热，体温升高达40～41.5℃，精神不振，食欲减退或废绝，常常横卧在一起，呼吸困难，剧烈咳嗽，呈腹式呼吸，有犬坐姿势，夜里可听到病猪哮喘声，个别病猪关节疼痛。如果在发病期治疗不及时，则易并发支气管炎、肺炎和胸膜炎等，病死率大大增加[5]。母猪在怀孕期感染，产下的仔猪在产后2～5d发病很重，有些在哺乳期及断奶前后死亡。病死剖检可见喉、气管及支气管充满含有气泡的黏液，黏膜充血，肿胀，时而混有血液，肺间质增宽，淋巴结肿大，充血，脾肿大，胃肠黏膜有卡他出血性炎症，胸腹腔、心包腔蓄积含纤维素物质的液体。

目前针对甲型流感病毒，现有的检测技术包括，病毒分离培养、血凝抑制（HI）与血凝（HA）试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫胶体金技术等。其中，作为检测病毒“金标准”的分离培养，由于其培养时间长，需要一定的培养技术而未广为使用；至于分子生物学检测，大多都是针对不同亚型的特异检测方法，对筛选所有甲型流感病毒具有一定的局限性；而免疫胶体金技术主要应用于暴发疫情初筛大量病例的快速检测，但灵敏度较低，检出率不高，常常受到限制[6]。本次所采用的ELISA方法敏感性高、操作简便、快速高效、便于大规模检测。据介绍，ELISA是Engvall等在1971年所建立的一种检测方法，以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种检测技术。常规的ELISA测定方法分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法[7]。在实际应用时，因该技术的不断改进，又形成了很多分析方法，这些方法，有检测抗原的，如测定病毒和血清抗体；有单抗介导的，有多抗介导的，还有的利用分子生物学为基础能够鉴别疫苗株和野毒株，在灵敏度、特异性、操作方便及快速高效等方面都有改进。除在生命科学领域得到广泛应用，还应用于农业、渔业、畜牧业和食品加工业等。

鉴于甲型流感病毒的抗原易变性和传播速度快，对甲型流感的检测和防控造成很大困难，甚至严重威胁动物和人类的健康[8]。因此，本试验主要用针对甲型流感所有亚型的ELISA试剂盒检测多地区猪和羊血清中甲型流感抗体水平，及时了解甲型流感的流行状况，为该病的综合防控和检测提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 采自安徽省铜陵市，安徽省蚌埠市及滁州市凤阳县养殖场的猪、羊的血清。其中猪血清来源于3家养殖场、羊血清采自1家养殖场。各地区养殖场血清加样的顺序：地区1：G（001-091）S（1-40）、地区2：S（41-77）、地区3：S（78-91）。

1.1.2 仪器设备 酶标仪（生产厂家：京奕瑞祥科技有限公司）、抗凝管（生产厂家：山东奥塞特医疗器械有限公司）、冷冻离心机（生产厂家：上海赫田科学仪器有限公司）、离心管（生产厂家：山东万吉塑料科技有限公司）、5mL注射器。

1.1.3 主要试剂 ELISA试剂盒（生产厂家：北京爱德士元亨生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 从铜陵市、凤阳县和蚌埠市采集猪和羊的抗凝血各91份，分别来源于3家地市级定点养殖场，样品送至实验室后进行离心，分离血清。

1.2.2 ELISA检测 采集的血清用针对甲型流感的ELISA试剂盒进行检测。

1.2.2.1 测定方法 （1）取出抗原包被板并在记录表上标记好被检样品的位置；（2）在两孔中分别加入100μL未稀释的阴性作为对照；（3）在两孔中分别加入100μL未稀释的阳性作为对照；（4）将100μL稀释好的被检样品加入相对应的孔中；（5）置于18～26℃孵育60min；（6）每孔加约350μL的洗涤液进行洗板，共需洗涤3～5次；（7）每孔加100μL酶标抗体；（8）置于18～26℃孵育30min；（9）重复第六步；（10）每孔加100μL的TMB底物液；（11）再置于18～26℃孵育15min；（12）每孔加100μL的终止液终止反应；（13）酶标空气调0；（14）测定各孔在650nm波长处的吸光值A（650）。

1.2.2.2 结果判定 只有阴性对照平均吸光度A（650）大于或等于0.600，阳性对照的平均值S/N小于0.50，该检测结果才能成立。如果出现不成立的结果，首先应该看操作是否存在问题，并重新检测。检测样品中是否含有A型流感病毒的抗体由该样品的测定值与阴性对照平均值的比例（S/N）决定：S/N小于0.60，判为A型流感病毒抗体阳性，S/N大于或等于0.60，判为A型流感病毒抗体阴性，具体加样如表1和表2所示。

1.2.2.3 数据处理 （1）阴性对照平均值（NCx）=[孔1A（650）+孔2A（650）]/2；（2）阳性对照平均值（PCx）=[孔3A（650）+孔4A（650）]/2；（3）S/N比值=样品值（650）/阴性对照平均值（NCx）。

2 结果与分析

2.1 S/N值测定结果 根据每个样品的OD值测定结果，计算出每个样品的S/N值，如表3、表4所示。由表3可以看出，从凤阳县养殖场采集的91份羊血清中共有3份为甲型流感阳性，阳性样品分别为G41、G43、G47。由表4可以看出，从铜陵、蚌埠和凤阳3地养殖场采集的91份猪血清中共有21份为甲型流感阳性：养殖场1中S14、S17、S18、S20、S24、S26、S31、S32共8份样品；养殖场2中S56、S67、S72、S73、S77共5份样品；养殖场3中S78、S80、S81、S83、S84、S85、S86、S91共8份样品。

2.2 甲型流感阳性率统计结果与分析 由以上样品的S/N值可以得出不同采样地区猪和羊血清中甲型流感的阳性率，如表5、表6所示。由表5可以看出，在采集到的91份羊血清样品中，有3份显示出阳性，其阳性率为3.3%。由表6可以看出，在从3地养殖场采集到的共91份猪血清样品中，有21份显示出阳性，其阳性率为23.1%。

3 讨论与小结

3.1 讨论 目前，甲型流感主要在猪和禽类中间流行，而对于羊的感染率相对较低，因此对其研究较少。本研究利用ELISA方法对91份羊血清和91份猪血清的流感病毒的抗体检测，检测出91份羊血清样品中甲型流感的阳性率为3.3%，91份猪血清样品中甲型流感的阳性率为23.1%。文献记载，李凯航等利用HI和HA的方法曾于2010年5月检测从上海地区养殖场所采集到的30份猪血清的H1N1亚型的抗体水平，测定的阳性率为30%；而孙忠晟[9]也运用此法对广东地区养殖场提供的猪血清样品进行检测，阳性率为21.7%。

实际试验当中酶联免疫吸附试验方法对于流感病毒的检测比更为简单、灵敏和准确。该方法主要采用的是抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，通过酶与底物产生颜色反应，进行定量测定。在试验过程中，以下要点需要引起重视。首先，所采集到的血液样品一定要保证新鲜，而且操作也要在无菌环境下进行。这是因为，菌体里面可能含有内源性辣根过氧化物酶，会导致假阳性反应的出现；其次，一般来说，5d以内采集到的样品在4℃下保存，超过一周的需进行低温保存。由于反复冻融会使抗体效价跌落，对于低温保存的冻结血清，取出后应轻缓地充分混匀，切不可在混匀器上进行强烈震荡；再次，试剂的准备要严格按照试剂盒说明书所要求配置，比如需要用到的蒸馏水或者去离子水，用于洗涤，应是新鲜的和高质量的，加样的时候也要注意使用微量加样器按照规定的两加入对应的板孔中，每次加样都需更换枪头，避免交叉污染；最后，在保温的过程中，加入板孔中的样品里不是所有的抗原都能和固相抗体结合。只有在最贴近孔壁出的才可以。这是一个逐步平衡的过程，需经扩散才能达到反应的终点。

据相关报道，甲型流感的暴发与流行对养殖业会造成一定的危害，因而养殖生产者应高度重视对猪和羊（尤其是猪）流感的防控[10]。对于甲型流感所应采取的措施有如下。第一，加强源头控制，坚决切断污染源头，做好养殖场坏境的消毒、粪便清理等工作，如疫病已发生，及时上报有关部门，进行疫区封锁，在疫区接触封锁前或疫病发生后对可能残留的病原体进行全面彻底地消毒，第二，加强过程控制和末端控制，对于可能产生或传播甲型流感病毒的污染物，要求进行无害化处理；第三，针对当前我国猪流感病毒日趋复杂，亟需建立长期有效的监测体系，以掌握猪流感病毒的流行情况，从而实施科学防控。这样不仅减少对养殖业的直接经济损失，也可以降低出现新流感毒株的风险，具有十分重要的公共卫生学意义[11]。

3.2 小结 本研究用ELISA方法检测羊血清中甲型流感的阳性率为3.3%，猪血清中甲型流感的阳性率为23.1%，表明甲型流感在安徽地区有一定流行，应采取防重于治的原则。

参考文献

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[9]孙忠晟，尹燕博，王平，等.间接ELISA检测猪流感抗体方法的建立及应用[J].中国兽医杂志，2011（01）：78-80.

[10]孙彦伟.广东部分规模猪场猪流感血清学监测结果与分析[J].广东畜牧兽医科技，2006，31（5）：28-30.

[11]谢海燕，朱燕秋，曾庆泉，等.东莞市猪流感的监测及风险评估[J].中国动物检疫，2012，29（4）：61-62.

（责编：张宏民）