黄芪破壁饮片与传统饮片5种有效成分在大鼠体内的药代动力学研究＊

邓银爱，杨泽锐，邓 雯，成金乐＊＊

（1.广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心 广州 510006；2.国家中医药管理局中药破壁饮片技术与应用重点研究室 中山 528437；3.广东省破壁粉粒工程技术研究开发中心 中山 528437）

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌等功效[1]。黄芪破壁饮片是由黄芪常规饮片通过超音速气流粉碎技术将传统中药饮片粉碎至D90＜45 μm（300目以上）的粉体，再经过不添加成型剂专利技术制成的30-100目的颗粒状饮片[2]。研究表明，黄芪主要含有黄芪皂苷、黄酮类以及黄芪多糖三大类活性成分。目前同时测定黄酮皂苷类及黄酮类成分主要有HPLC-DAD-ELSD以及LC-MS法[3,4]，关于黄芪破壁饮片的药代动力学研究笔者未见国内（外）文献报道。

本研究应用UPLC-MS/MS同时测定了大鼠血浆中黄芪的5种有效成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素），并比较了黄芪传统饮片水煎液与黄芪破壁饮片混悬液5种有效成分在大鼠体内药动学特点，为黄芪破壁饮片后续的体内代谢机理提供了参考依据。

1 实验材料

1.1 试药与仪器

黄芪破壁饮片（广东省中山市中智药业集团有限公司，批号为20160825）、黄芪传统饮片（广东省中山市中智药业集团有限公司，批号为20160825），经广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心詹若挺研究员鉴定为豆科植物蒙古黄芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根；黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品(中药固体制剂制造技术国家工程中心，纯度均≥98%；批号分别为BGTG-0302、BGTG-0445、BGTG-0111、BGTG-0455、BGTG-0444)；内标柚皮素(中药固体制剂制造技术国家工程中心，纯度≥98%；批号为BGTG-0809)。

表1 洗脱条件表

高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，型号：1290)；三重四级杆质谱仪（美国安捷伦公司，型号：6470）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ3200E型）；旋转蒸发仪（德国IKA公司，型号：RV10 basic plus）；离心机（德国艾本德公司，型号：Eppendorf 5427R）；氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司，BF-2000）；氮气一体机（北京中兴汇利科技发展有限公司，型号：NA-5L）；涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司，型号：VX-Ⅲ）；恒温烘箱（上海博讯医疗设备厂，型号：HPX-9052MBE）。

1.2 实验动物

SD大鼠，SPF级，雄性，体重约350-400 g，购自中国人民解放军军事医学研究院基础医学研究所，许可证编号：SCXK-（军）2012-0004。实验前禁食12 h，自由饮水。

2 实验方法

2.1 对照品与供试品溶液制备

精密称取黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素适量，加甲醇溶解分别制备为23.4 μg·mL-1、33.6 μg·mL-1、28.4 μg·mL-1、32.6 μg·mL-1、29.4 μg·mL-1的对照品储备液。

精密量取对照品适量，加入甲醇稀释配制成黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素浓度分别为 46.80 ng·mL-1、50.40 ng·mL-1、48.28 ng·mL-1、48.90 ng·mL-1、49.98 ng·mL-1的标准品溶液。

精密称取黄芪传统饮片42 g，置于圆底烧瓶中，加入420 mL水，浸泡30 min，煮沸，回流提取两次，每次30 min，合并两次滤液，减压浓缩滤液至200 mL，稀释成0.14 g·mL-1，即得丹参传统饮片水煎液。

精密称取黄芪破壁饮片14.00 g，置于研钵中，慢慢加入水，研磨均匀，使成0.14 g·mL-1，即得黄芪破壁饮片混悬液。

2.2 给药和样品采集

取健康大鼠18只，雄性，分为2组，每组9只，即黄芪破壁饮片混悬液组和黄芪传统饮片水煎液组。实验前12 h禁食，自由饮水，将配置好供试药液按照2.5 mL·100g-1灌胃给药，每种形态药材灌胃9只大鼠，给药后4 h后内禁食禁水，给药前采集空白血样，灌胃后于5 min、15 min、30 min、1 h、2 h，3 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h、36 h、48 h、72 h眼眶取血0.5 mL，置EDTA管中，5 000 rpm离心10 min，分离血浆，-20℃冷冻保存备用。

2.3 色谱与质谱分析条件

色谱条件：色谱柱为 Agilent XDB-C18（1.8 μm，3.0×50 mm）；流动相A为0.1%甲酸-水溶液，流动相B为0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脱（洗脱条件见表1）；柱温为30℃；进样器温度为20℃；流速为0.2 mL·min-1（前一分钟不进质谱）；进样体积为2 μL。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI）；检测方式为正离子模式；扫描方式为多反应监测模式（MRM）；毛细管电压为3 500 V；氮气温度为300℃，氮气流速为5 L·min-1；鞘气温度为250℃，流速为11 L·min-1；喷嘴电压为500 V。在此条件下检测离子的信息如表2所示。

2.4 血浆样品的处理

室温解冻样品后，精密吸取100.0 μL内标溶液置于5 mL离心管中，N2吹干，再吸取100 μL供试品溶液，涡旋混合，加入400 μL蛋白沉淀剂（0.1%甲酸），涡旋混合2 min，超声4 min，13000 rpm 离心5 min，分离上清液400 μL于N2吹干，残渣用150 μL甲醇复溶，涡旋混合2 min，超声4 min，13 000 rpm离心5 min，取上清液2 μL进行UPLC-MS/MS分析。

2.5 数据处理

药动学参数由DAS 3.2.6药动学软件处理得到，结果采用IBMSPSS 19.0统计软件，进行数据分析。所有数据以平均数±标准差表示，数据取对数之后两组间比较采用独立样本T检验，三组之间比较采用单因素方差分析，方差不齐则选用非参数检验；P＜0.05认为具有显著性差异。P＜0.01认为具有极显著性差异。

表2 检测离子信息

3 实验结果

3.1 色谱行为及专属性

空白血浆、含对照品血浆、含药血浆离子流图如图1，结果显示黄芪中5种有效成分与血浆中其他组分分离完全，峰形良好，黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素保留时间为6.9 min、3.2 min、4.3 min、5.2 min、6.7 min。。

3.2 线性范围和定量限、检测限

以对照品浓度为横坐标（X）,峰面积比为纵坐标（Y），进行线性回归，得到黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的回归方程分别为Y=0.0002X+0.0002、Y=0.0024X-0.0048、Y=0.0057X-0.0141、Y=0.0012X-0.0013、Y=0.0023X-0.0005；浓度依次在 0.91-468.00、0.98-504.00、0.94-482.90、0.95-489.00、0.97-499.80 ng·mL-1线性关系良好，相关系数r均大于等于0.9954；定量限依次为0.91 ng·mL-1、0.98 ng·mL-1、0.94 ng·mL-1、0.95 ng·mL-1、0.97 ng·mL-1；检测限依次为0.30 ng·mL-1、0.33 ng·mL-1、0.31 ng·mL-1、0.32 ng·mL-1、0.32 ng·mL-1。

3.3 精密度与准确度

取质控样品于日内和日间各测量6次，连续测定3天，计算精密度。黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素日内精密度分别为7.24%、5.02%、4.39%、5.48%、2.89%，日间精密度分别为2.83%、2.73%、3.86%、3.39%、2.12%。日内、日间RSD均小于10%（n=6），本法所建立的分析方法精密度生物样品定量分析指导原则的要求。

3.4 基质效应及回收率

取血浆样品测定峰面积，与流动相配制的相同浓度对照品溶液所测峰面积相比，计算血浆的回收率。黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素基质效应分别为90.60%、95.40%、92.93%、80.96%、100.54%；回收率分别为92.74%、102.02%、102.99%、106.65%、100.20%（n=6），5种成分的基质效应以及回收率均在80%-120%之间，符合生物样品定量分析指导原则的要求。

图1 大鼠血浆样品总离子流图

图2 黄芪破壁饮片和传统饮片中5种有效成分血药浓度-时间曲线(Xˉ±SD,n=9)

表3 黄芪破壁饮片与传统饮片在大鼠血浆中5种有效成分的主要药代动力学参数(±SD,n=9)

表3 黄芪破壁饮片与传统饮片在大鼠血浆中5种有效成分的主要药代动力学参数(±SD,n=9)

注：1-5分别代表黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素成分；A：破壁饮片，B：传统饮片；与B相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

成分饮片药动学参数1 2 3 4 5相对生物利用度2.67±1.18 1.79±0.50 1.46±0.48 2.41±0.58 A B A B A B A B A B Cmax/μg·L-1 7.91±1.54**5.379±1.48 4.28±0.56**3.00±0.24 5.43±103.02**3.49±0.33 3.32±1.33*1.95±0.81 5.43±2.11 4.63±0.98 Tmax/min 318.31±434.10**180±213.71 30.55±56.64 36.66±38.07 8.33±1.21**18.88±8.93 50.55±79.93 41.11±45.81 8.33±5 13.33±7.90 T1/2/min 480±103.92 214.56±148.26 87.31±28.6**41.81±0.29 103.42±22.14 140.16±90.93 94.08±49.86*219.22±13.29 125.83±18.10**210.86±17.37 AUC0-t/（μg·L-1*min）5 166.19±1 594.72**2 222.64±940.73 1 018.29±294.62**572.85±103.61 966.27±199.05*702.13±192.89 528.96±169.66**230.08±78.79 749.73±201.94**429.09±93.22 AUC0-∞/（μg·L-1*min）6 079.20±3 313.60**2 306.60±1 010.76 1 018.37±294.68**572.85±103.61 966.42±199.10 806.54±465.08 529.03±169.64**230.08±78.79 749.73±201.94**429.09±93.22 1.78±0.46

3.5 黄芪破壁饮片和传统饮片5种成分在大鼠体内药动学研究

黄芪破壁饮片混悬液和黄芪传统饮片水煎液灌胃给药后，大鼠血浆中5种成分药时曲线见图2，药动学参数见表3。结果显示，两者5种有效成分的药时曲线趋势相似，具有相似的代谢行为，黄芪破壁饮片混悬液中5种有效成分的生物利用度均高于黄芪传统饮片水煎液。

4 讨论

黄芪破壁饮片与传统饮片中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的AUC0-t、AUC0-∞均具有显著性差异，以传统饮片为参比制剂，其相对生物利用度分别为2.67±1.18、1.79±0.50、1.46±0.48、2.41±0.58、1.78±0.46，且5种成分药-时曲线具有相似性，均出现双峰现象。

由实验结果可知，对大鼠灌胃给予黄芪破壁饮片混悬液及黄芪传统水煎液，破壁饮片黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素生物利用度分别提高了167%，79%，46%，141%，78%。结合本实验在此研究之前对黄芪破壁饮片煎煮、冲泡与传统饮片煎煮后5种有效成分溶出含量进行比较，发现黄芪破壁饮片煎煮5-10 min可达到传统饮片煎煮30 min的效果，破壁饮片最优工艺冲泡15 min后5种成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素）可达到传统饮片煎煮溶出量的80%-90%[5]，黄芪破壁饮片体外溶出量等于或低于传统饮片水煎液溶出量。黄芪破壁饮片混悬液5种有效成分的生物利用度均比传统饮片水煎液高的原因之一是黄芪破壁饮片粉体粒径小，已达到破壁状态，由于经植物细胞壁粉碎，可使有效物质更好地溶出释放，同时提高药物在胃肠道的分散度和溶出度使药物的药效增强[6]；原因之二是黄芪传统饮片水煎液中能被体内吸收利用的有效成分含量为溶于水中的总量，药渣中残留的有效成分无法利用。黄芪破壁饮片混悬液进入体内后，破壁粉体中的有效成分持续溶出，体内可吸收利用的有效成分含量是粉体中所包含的所有物质的总量，因此药物吸收利用率大幅提升，从而提高了活性成分生物利用度。

本研究室在该研究前对破壁饮片混悬液与传统饮片水煎液的药效、急性毒性进行比较研究，其研究结果与本文结论相似，具体研究如下。决明子破壁饮片混悬液为传统饮片1/2剂量以下，小鼠小肠推进作用与传统饮片常规量效果相似[7]。丹参破壁饮片在低于传统饮片的剂量下即可发挥与传统饮片相似的药效，且丹参破壁饮片和传统饮片用药安全性相似[8]。参斛复方中药破壁饮片在给药剂量仅为参斛复方中药合剂的1/3条件下，改善冠心病的胸闷、胸痛、心悸等症状的疗效更佳[9]。丹参破壁饮片混悬液与丹参传统饮片水煎液中的丹参酮ⅡA和隐丹参酮在人体内生物不等效，破壁饮片混悬液中丹参酮ⅡA和隐丹参酮生物利用度明显高于传统饮片水煎液[10]。

由实验结果可知，5种成分药-时曲线均会出现双峰现象，文献报道其原因之一可能是其存在肝肠循环现象。肝肠循环是指经胆汁或部分经胆汁排入肠道的药物，在肠道中又重新被吸收，经门静脉又返回肝脏的现象[11]。另外一种解释就是可能药物在胃肠道存在多吸收位点，因此导致其出现双峰现象[12]。至于其具体是通过哪一种机制，现有研究资料并未能给出明确解释，后期工作可对其机制进行深入研究，以探明相关机制。

中药破壁饮片是一种创新型中药饮片，提高了中药饮片的均匀性、利用率，满足现代人的用药需求。

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