羧甲基壳聚糖对脂质体肺部吸收的影响

周佳琦 王小娇 陆亚媛 胡琦兰 陈西敬 陈丁丁

肺部给药作为一种非侵入性的给药方式日益受到医药界的重视, 无论其用于局部用药还是全身治疗。近年来, 壳聚糖(chitosan, CS)在肺部给药领域被广泛地研究, 应用于各种剂型 , 如 CS 包裹的脂质体［1］、纳米粒［2］以及干粉吸入剂［3,4］。但是, CS仅在酸性条件下溶解, 不适合在中性条件下包载药物, 这限制了其应用［5］。因此, 许多科研工作者将兴趣转向CS的衍生物或将CS进行结构改造, 以期获得更好的理化性质、提高其生物降解性能、减低毒性［6］。羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan, CMCS)是一种水溶性的CS衍生物,在较宽的pH范围内呈现较好的溶解性［7］。研究表明, CMCS有着与CS相似的性质, 如低毒性、生物相容性和生物可降解性［8］。目前, CMCS修饰的纳米粒或脂质体在递送抗癌药物、蛋白质药物、基因和抗体药物等方面均被深入研究［9］。但是, 到目前为止, 还没有将CMCS修饰的纳米制剂应用于肺部给药的研究。本研究选择一种治疗非小细胞肺癌的小分子药物吉非替尼(Gefitinib, GEF)作为模型药, 制备普通GEF脂质体(GEF-LPs)、取代度为0.6的CMCS修饰的GEF脂质体(0.6 CMCS-GEF-LPs)以及取代度为0.9的CMCS修饰的GEF脂质体(0.9 CMCS-GEF-LPs), 考察这三种脂质体通过肺部给药后, 吉非替尼在肺部、肺泡灌洗液以及血浆中的分布情况,为CMCS进一步应用于肺部给药提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 吉非替尼, 厄洛替尼(大连美仑生物技术有限公司)；羧甲基壳聚糖(青岛云宙生物科技有限公司)；大豆磷脂(上海太伟药业有限公司)；胆固醇(百灵威科技有限公司)；二氯甲烷, 乙酸乙酯(南京化学试剂有限公司)；乙腈(美国Tedia天地试剂有限公司)。

1.2 仪器 TSQ Quantum Access三重四极杆串联质谱仪,配备电喷雾离子源(ESI)及Xcalibur 2.0.7数据处理系统(美国Thermo Scientific公司)；岛津LC-20AD液相色谱系统；激光散射粒径分析仪(Brookhaven, 美国)；探头超声细胞破碎仪(Sonics公司)；旋转离心浓缩仪(上海爱郎仪器有限公司, 型号EYELAN-1100)；高速冷冻离心机(Eppendorf型号5430-R)。

1.3 动物 SD大鼠, 体重180～220 g, 由上海杰思捷实验动物有限公司提供, 实验动物许可证号：SYXK(沪)2013-0006。

1.4 方法

1.4.1 普通吉非替尼脂质体的制备 本实验采用薄膜分散法制备吉非替尼脂质体。称取100 mg大豆磷脂、10 mg 胆固醇以及2.5 mg 药物, 用20 ml二氯甲烷溶解后置于圆底烧瓶中。减压蒸干有机溶剂至在烧瓶底部形成一层薄膜。加入8 ml去离子水水合, 间歇超声(超声1 s, 停2 s)3 min得到均匀脂质体混悬液。用0.22 μm微孔滤膜过滤, 即得到普通吉非替尼脂质体。

1.4.2 CMCS修饰的吉非替尼脂质体的制备 称取适量的CMCS, 加去离子水溶解, 使其形成浓度为0.2%(W/V)的CMCS水溶液。向上述制得的普通脂质体中分别滴加入等体积不同取代度的两种CMCS溶液, 室温下磁力搅拌30 min,即得CMCS修饰的吉非替尼脂质体。

1.4.3 粒径、分散系数、电位的测定 分别取制备好的3种脂质体, 加去离子水稀释后, 用激光散射粒径分析仪测定平均粒径以及多分散系数(PDI)。另取稀释后的脂质体, 用Zeta电位分析仪测定表面电位。

1.4.4 包封率的测定 取脂质体混悬液, 用乙腈破乳、稀释后测定GEF的浓度, 得到药物的总含量；另取脂质体适量,以5000 r/min离心5 min除去游离的GEF［10］, 取上层脂质体,同上法破乳稀释后测定浓度, 得到包裹在脂质体中药物的含量。GEF的含量用“1.4.6 样品测定方法”所述的LC-MS/MS方法测定。包封率=包裹在脂质体中药量/总药量×100%。

1.4.5 大鼠组织分布试验 取27只SD大鼠, 随机分成3组,每组9只, 分别通过肺部给予GEF-LPs、0.6CMCS-GEF-LPs和0.9CMCS-GEF-LPs。剂量均为0.7 mg/kg。肺部给药方法为注射器气管滴注。3组分别于给药后0.5、1、3 h将3只大鼠股动脉放血处死, 收集血浆、肺泡灌洗液以及肺组织。

肺组织样品处理：取组织称重、剪碎, 加入生理盐水制成匀浆液。在1.5 ml离心管中加入厄洛替尼(内标)50 μl, 挥干溶剂。再将样品50 μl加入到离心管中, 涡旋混匀。加入萃取试剂(乙酸乙酯)400 μl, 涡旋混匀5 min, 15000 r/min离心5 min。取上清300 μl至另一套离心管中, 挥干溶剂, 残渣用乙腈100 μl复溶后用于LC-MS/MS分析。

1.4.6 样品测定方法 本试验通过LC-MS/MS法测定GEF的浓度。液相条件：色谱柱：岛津BDS Hypersil C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 5μm)；流动相：乙腈 -5 mM乙酸铵 (70∶30)；流速：0.35 ml/min；柱温：40℃；进样体积：10 μl。质谱条件：离子源温度：400℃；喷雾电压：4.5 kV；加热毛细管温度：400℃；鞘气压力：35 Arb；辅助气压力：25 Arb；碰撞气压力：1.5 mTorr；正离子方式检测；扫描模式：多反应检测模式(MRM)。用于定量分析的离子：447.0 → 128.0 m/z(GEF)和395.0 →278.7 m/z(厄洛替尼)。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 吉非替尼脂质体的理化性质 本试验制备的吉非替尼脂质体的包封率较高, 用浓度为0.2%的两种取代度的CMCS包覆GEF脂质体后, 包封率略微降低, 脂质体的粒径、PDI略有增大。由于CMCS在生理pH下带负电［5］, CMCS使原本带正电的普通脂质体转变为带负电。制备得到的三种脂质体均具有较高的包封率, 适中的粒径和分散系数, 且Zeta电位较高, 说明体系较为稳定。脂质体包封率、粒径、PDI、Zeta电位的结果。见表1。

表1 不同取代度的CMCS包覆GEF脂质体包封率、粒径、PDI、Zeta电位比较

表1 不同取代度的CMCS包覆GEF脂质体包封率、粒径、PDI、Zeta电位比较

三种脂质体 EE (%) Size (nm) PDI Zeta-Potential (mV)GEF-LPs 94.0±1.23 131.2±3.1 0.168 +27.81±2.1 0.6CMCS-GEF-LPs 90.6±0.68 155.7±4.3 0.245 -28.38±3.2 0.9CMCS-GEF-LPs 91.8±1.85 149.7±2.9 0.211 -27.40±3.5

2.2 不同组织分布结果 在0.5 h时, 两种CMCS修饰的脂质体在肺部和肺泡灌洗液中的浓度明显低于普通脂质体组,差异有统计学意义(P<0.05)。在1 h和3 h时, 3种脂质体在肺部、血浆、肺泡灌洗液中药物分布比较, 差异均无统计学意义(P＞0.05)。CMCS能够明显增加脂质体在肺部吸收的速度和程度, 但CMCS的取代度对脂质体在肺部的吸收没有显著的影响。GEF随时间在肺部、血浆、肺泡灌洗液中的分布。见表1、图1。

表1 大鼠肺部给予三种脂质体后在不同检测标本中的吉非替尼比较

表1 大鼠肺部给予三种脂质体后在不同检测标本中的吉非替尼比较

注：与GEF-LPs比较，aP<0.05

检测标本 时间(h) GEF-LPs(n=3) 0.6CMCS-GEF-LPs(n=3)0.9CMCS-GEF-LPs(n=3)肺组织(ng/g) 0.5 5655.87±297.52 3213.67±84.38a 3055.88±165.77a 1 2051.52±235.95 1667.23±36.09 1986.55±46.78 3 587.50±77.34 659.59±113.00 846.42±131.50血浆(ng/ml) 0.5 99.21±9.63 185.76±15.09a 181.96±27.10a 1 103.88±5.32 101.95±6.51 100.52±6.77 3 39.29±2.32 44.28±1.07 37.33±0.61肺泡灌洗液(ng) 0.5 1126.80±173.44 453.22±130.31a 428.98±68.00a 1 273.67±40.14 203.25±124.85 179.33±75.43 3 41.57±13.68 76.63±56.85 56.22±23.96

图1 吉非替尼在三种脂质体经肺给药后的肺动力学和组织分布

3 讨论

CMCS被广泛应用于药物载体, 既可以制成凝胶单独作为药物载体, 又可以修饰其他载体材料(如脂质体), 以满足不同理化性质不同给药途径药物的给药需要［5］。但是目前对CMCS的研究主要集中在其对被修饰药物载体的稳定性、pH敏感性、缓释作用等的影响上, 尚未有研究者考察CMCS对于药物肺部给药的影响, 本文为CMCS在肺吸入制剂方面的研究提供参考。

在研究前期, 通过单因素考察和正交实验确定了吉非替尼脂质体的处方配比和工艺条件, 使脂质体具有较高的包封率和适合的粒径。同时通过预实验确定以0.2% CMCS(W/V)来修饰脂质体, 此浓度对于脂质体的包封率影响小。

组织研究结果说明CMCS有助于脂质体透过肺泡壁进入毛细血管, 提高肺部给药药物的生物利用度。根据在壳聚糖上羧甲基取代的程度, 将其分为不同取代度的CMCS。徐云龙等［10］发现羧甲基壳聚糖的羧甲基取代度对于脂质体pH敏感性有一定程度的影响。但是, 羧甲基取代度对于吉非替尼脂质体在肺部的吸收没有显著影响(P＞0.05)。

CS目前作为肺部给药的药物载体已被广泛研究, 而对于它的水溶性衍生物CMCS的研究在此方面还是空白。本文的研究结果说明CMCS能够明显增加脂质体在肺部吸收的速度和程度, 因此将CMCS应用于肺吸入制剂可能具有一定前景。将CMCS单独作为载体或与其他药物载体合用在肺部递送药物是否也会改变药物在肺部的吸收特性尚需要更多的研究。

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