正交试验优化裸花紫珠水提取工艺及外用止血作用的评估△

张仲，罗贤强，周金娜，周小芳，黄明浩，张俊清1，*，罗喻超*

(1.海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海南 海口 571199；2.海南医学院药学院，海南 海口 571199)

裸花紫珠CallicarpanudifloraHook.et Arn为马鞭草科紫珠属(CallicarpaLinn.)植物，又名赶风柴、节节红、百花茶、饭汤叶、亚赛凡等[1]，主要分布于我国海南，广西，广东等地，裸花紫珠是海南常用黎药材[2]。主要分布于白沙，五指山琼中等地。裸花紫珠作为药材四季均可收获，取裸花紫珠的地上干燥部分，阴干，去除杂质用药，具有抗菌、消炎解毒、收敛止血、祛风除湿的功效，临床上用于急性传染性肝炎、化脓性炎症、消化道出血等症，外用常用于治烧伤、烫伤及外伤出血等。现代研究表明，裸花紫珠主要含有黄酮、鞣质、萜类和酚类等成分[3-4]，其中的苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷(acteoside，AS)有显著缩短活化部分凝血活酶时间(APTT)作用，提示裸花紫珠可能是通过影响内源性凝血途径来发挥止血作用，其中毛蕊花糖苷在药材中的含有量很高，可能是裸花紫珠止血的主要活性成分[5]。

市场调查发现，目前市场上裸花紫珠制剂已有片剂、胶囊剂、合剂、分散片、栓剂和阴道片剂等剂型[6]，但是缺少用于止血的外用制剂，研制裸花紫珠外用止血贴不仅可以填补市场的空缺，还能通过贴剂的特点更好发挥裸花紫珠的止血效果。本论文通过正交试验对裸花紫珠的水提取工艺进行优化，并进行了工艺验证实验。用最佳提取工艺所获得的水提取物进行了外用止血实验，对止血的效果进行了评估。这些都为将来裸花紫珠止血贴的研发提供了基础。

1 材料与仪器

1.1 动物

清洁级家兔，购买于广东省医学实验动物中心，合格证号：SDWA-44060506-0403-20170330-00001，雌雄各半，体重2.2～2.5 kg。

1.2 药物及试剂

裸花紫珠于2016年5月采自海南省白沙县，经海南医学院药学院田建平教授鉴定为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠CallicarpanudifloraHook.et Arn；吸水垫(7.5 cm×7.5 cm×0.1 cm)购买于优玖责任有限公司；云南白药创可贴(批号：PJE1628)；甲醇、醋酸、无水乙醇均为分析纯，购自广州化学试剂厂，乙腈为色谱纯，水为超纯水。

1.3 仪器

北京赛多利斯仪器系统有限公司SO9001型电子天平；上海博讯实业有限公司医疗设备厂GXZ-9240型数显鼓风干燥箱；上海亚荣生化仪器厂RE-52AA型旋转蒸发器。Shimadzu LC-2010AHT高效液相色谱仪(配有紫外检测器，自动进样器，LC solution色谱工作站)。

2 方法与结果

2.1 裸花紫珠提取工艺的考察

2.1.1 浸膏得率的测定 精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥24 h，迅速转移至干燥器中冷却0.5 h，迅速精密称定质量，计算浸膏得率。计算浸膏得率。

(1)

2.1.2 毛蕊花糖苷的测定 依照本实验室王勇等[7]建立的色谱条件：Luna C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈-0.1%醋酸水溶液(15∶85)，流速1.0 mL·min-1，检测波长332 nm，柱温30 ℃。精密称取毛蕊花糖苷对照品25.8 mg，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成毛蕊花糖苷浓度为1.032 mg·mL-1的标准品溶液。然后分别吸取一定体积的该溶液置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别稀释成6种浓度分别为0.103 2、0.206 4、0.412 8、0.516 0、0.619 2、0.825 6 mg·mL-1的对照品溶液。各浓度的溶液分别进样2 μL，测定毛蕊花糖苷的峰面积，以毛蕊花糖苷的进样量(μg·μL-1)为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到毛蕊花糖苷的回归方程为Y=3.574×106X-40 115，r=1.000 0，线性范围为0.103 2～1.032 μg·μL-1。

取裸花紫珠提取后的浓缩液0.5 mL，置25 mL量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度。取适量，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，测定，记录色谱图，计算毛蕊花糖苷(AS)提取率。

2.1.3 药材水提取工艺因素与水平 裸花紫珠茎叶中主要的成分毛蕊花糖苷易溶于水，因此采用水加热回流提取方法，采用蒸馏水回流提取。由于裸花紫珠叶的吸水率较大[7]，故在选择加水量的水平时第1次加入量比后两次大。选取考察加水量，浸泡时间，提取时间和提取次数4个因素。结合参考文献[7-9]，并进行了预实验，最终选取了每个因素的考察水平，因素水平见表1。

表1 裸花紫珠水提取水平因素表

2.1.4 提取工艺正交试验方法 取裸花紫珠地上干燥部分，将茎叶剪成均一大小，分成9份，每份约20 g，依次编号为1～9组。按照表2中L9(34)正交表规定的条件进行回流提取，提取液用200目纱布过滤，浓缩，待浓缩液冷却后，加蒸馏水定容到100 mL，摇匀。按照2.1.1和2.1.2所述方法测定浸膏得率和毛蕊花糖苷含量。测定结果见表2及表3。

表2 提取工艺正交试验设计结果

注：综合评分=(浸膏得率/19.60×0.3+AS得率/1.77×0.7)×100。

表3 方差分析表

比较各因素的极差可知，因素D(提取次数)对试验结果影响最大，其次是C、B和A，所以因素对综合评分值指标影响大小排序为D>C>B>A。由方差分析可知，因素D具有显著性差异。根据极差分析各因素的均值，可确定裸花紫珠药材水提取最佳工艺为A2B3C2D3，即药材浸泡时间2 h后，提取3次，加水量分别为12，10，10倍量，每次提取时间为1 h。

2.1.5 工艺验证实验 称取裸花紫珠药材3份，每份50 g，按上述确定的最佳工艺条件提取，对药材水提取工艺进行验证，测定结果见表4。结果表明，由上述确定的最佳方案提取毛蕊花糖苷的提取率较高，该方案较为稳定。

表4 水提取验证实验结果 %

2.2 药效学评价

采用最佳提取工艺提取获得的流浸膏旋蒸浓缩，分别稀释至浸膏浓度为1.0、0.5 g·mL-1。吸取一种浓度的流浸膏1mL均匀分布于吸水棉垫2.4 cm×1.5 cm×0.1 cm后，50 ℃减压烘干1 h，分别制成高低两种含药浓度的止血棉垫，记录各棉垫的的质量。进行预实验[10-11]，选取市售的云南白药创可贴为阳性药。结果如表5所示，显示云南白药创可贴组的平均出血时间与0.5 g·mL-1组相当，而平均出血量要低于1.0 g·mL-1组。

表5 预实验结果

参考预实验的结果，制得含药浓度分别为0.5、1.0、2.0 g·mL-1的低中高三种止血棉垫。取成年家兔15只，随机分为5组，低、中、高剂量组、阴性对照组和阳性对照组。将家兔左耳与右耳对齐，于耳缘末端2/3、1/2、1/3处，用一次性采血针对家兔耳缘静脉穿刺1 cm，形成静脉出血后立即在出血处敷以制好的止血棉垫，并用100 g砝码压在棉垫上，5 s观察1次出血情况，直至出血停止。记录出血时间，并称量止血棉垫的质量，计算出血量。

结果见表6和表7。

表6 出血时间结果

注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01。

表7 出血量结果

注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01。

与空白组相比，裸花紫珠低、中、高剂量与云南白药创可贴均可以非常显著地减少出血量(P<0.01)，其中高剂量组的出血量要低于阳性对照组；此外，高剂量组相较空白组也可以明显地减少出血时间(P<0.01)，同时高剂量的出血时间也要低于阳性对照组。综上，说明裸花紫珠水提取物具有一定的外用止血作用，具有开发成外用止血贴剂的潜力。

3 讨论

在正交试验分析中，引进综合评价的理念，使用多指标综合加权评分法可以避免单一评价的片面性，使分析结果更加科学、客观，使得提取工艺趋于合理、可信[12]。本研究以浸膏得率、毛蕊花糖苷的提取得率为指标，采用正交试验设计，对裸花紫珠叶中苯乙醇苷类成分的水提取工艺进行研究，确定了最佳的提取工艺：药材加水浸泡2 h，提取3次，加水倍量分别为12、10、10，每次提取1 h。本研究确定的提取工艺简单可行，3次验证实验结果重复性较好，可为今后裸花紫珠茎叶的水提取提供参考，也为日后裸花紫珠制剂的开发提供基础。

本文进一步针对最佳提取工艺所获得的裸花紫珠浸膏，进行了外用止血药效学的研究。以出血时间和出血量为评价指标，先进行了预实验。参考预实验的结果，考察不同剂量对家兔耳缘静脉出血的影响。预实验和正式实验的动物数量、样本量以及实验方法都相同，且结果基本在同一水平，两次实验结果都有较好的重复性。此次研究，初步证明本浸膏具有一定的外用止血作用，尤其以2.0 g·mL-1的浓度给药时，作用效果十分显著，甚至要优于市售的云南白药创可贴，表明了本浸膏作为外用止血药物开发的潜力。本次研究，参考止血贴的制作流程，并采用了相应的材料，这也为裸花紫珠外用止血贴的研制提供了基础。

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