体外模拟生精微环境诱导人脐带来源的多能干细胞向男性生殖细胞方向分化的研究

刘思征 刘琴

（1汕头大学医学院第二附属医院儿科 广东 汕头 515041）（2汕头大学医学院第二附属医院妇产科 广东 汕头 515041）

1.前言

随着人类生存环境的不断变化，不育不孕症的发病率连年升高。据统计[1]，全球大约有12～15%的育龄夫妇受到不育不孕症的困恼，其中50%是由男性因素造成的。生殖细胞移植是治疗男性不育症的理想方法。功能生殖细胞的形成是一个复杂的过程，体外模拟合适的细胞微环境十分关键。人脐带间充质干细胞（HUMSC）是一种受到疾病和环境造成基因突变可能性极低的细胞，其来源的诱导多能干细胞（HUMSC-IPS）具有类似胚胎干细胞的多向分化潜能[2]。本研究在体外模拟精原细胞生长的三维环境，提供干细胞分化所需的电、机械刺激及细胞因子，观察HUMSC-IPS向男性生殖细胞分化的情况。

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 主要试剂及设备 DMEM/F12培养基；优质胎牛血清；TRIZOL试剂；BMP4蛋白；丝裂霉素C；SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RnaseH Plus)；台式高速离心机；Real-Time PCR仪；低温与超低温冰箱；超净工作台；CO2恒温培养箱；倒置显微镜等。

2.1.2 标本来源 脐带：取自汕头大学第二附属医院剖宫产出生的健康足月新生儿，均征得家属同意，放弃使用权，并经本院伦理委员会批准。HUMSC-IPS：来自本课题组前期液氮冻存细胞。

2.1.3 实验动物 昆明小鼠：3～4周龄及新生儿小鼠，从汕头大学医学院动物实验中心购买。

2.2 方法

2.2.1 小鼠睾丸支持细胞（SCs）的分离、培养及饲养层的制备出生1天昆明小鼠麻醉处死后，取出睾丸并剪碎，分离曲细精管并依次加入0.1%DNA酶、0.1%胶原酶Ⅳ、0.1%透明质酸酶，两次消化、离心、过滤后分装至六孔板里，加入培养基（DMEM/F12培养基+10%胎牛血清），37℃培养箱4小时后更换新鲜培养基。48小时后弃去旧培养基，PBS清洗后，加入无菌Tris-HCL低渗休克（20mmol/l，PH 7.4）2～3min，清洗后加入新鲜DMEM/F12培养基，放入培养箱，每隔2～3天换液一次。当第二代的SCs生长融合达到80%～90%时，弃去旧培养基，加入含15ug/ml丝裂霉素C的培养基孵育2h，清洗后加入0.05%胰蛋白酶/EDTA，消化、吹打、离心，将沉淀的细胞以H-DMEM培养基重悬，细胞的浓度是0.5×105/L，加入培养板里，在培养箱中保持单层贴壁培养，隔两天换一次液，通过培养4 d使其形成单层细胞饲养层及特殊的三维立体细胞接触表面。

2.2.2 HUMSC-IPS体外诱导自液氮中取出HUMSC-IPS冻存管，复苏后细胞悬液转移至饲养层皿上，轻摇培养板，使IPS克隆均匀分布于皿中，放入恒温培养箱中培养，第二天观察细胞贴壁情况，每日观察克隆生长情况并更换新鲜培养基。HUMSC-IPS贴壁饲养层上后，实验组更换为含有100ng/mlBMP4的IPS培养基，对照组更换为不含BMP4的IPS培养基，观察细胞生长情况，以首次更换含BMP4培养基前作为D0，分别收集D3、D7、D14、D21细胞。

2.2.3 检测SOX17和BLIMP1基因表达 将收集细胞用于RNA提取，以D0作为基础表达量，收集第0、3、7、14及21天的总RNA，通过RT-PCR检测生殖分化关键因子SOX17和BLIMP1表达量的变化。相同时间点利用两个独立样本T-检验，组内不同时间点之间的差异利用重复测量方差分析来检验表达量的变化。

3.结果

3.1 小鼠睾丸支持细胞（SCs）的分离、培养 采用三种酶连续消化及低渗性处理新生昆明小鼠睾丸，SCs容易贴壁，而生殖细胞不贴壁，利用这个特性很容易分离SCs。该方法分离培养出来的SCs纯度高，电镜下观察SCs上漂浮着一些圆形细胞即为生殖细胞，可见SCs呈单层膜状不规则形状。约1周后SCs铺满整个培养板，单个细胞胞质丰富，可见小空泡或颗粒状物，胞核大，呈椭圆形或圆形。

3.2 HUMSC-IPS体外诱导

IPS克隆呈圆形，边缘整齐，细胞连接紧密，如图1。倒置显微镜下观察，D0可见两组拟胚体大小大部分相近，形态均呈现出周缘光滑，聚集紧密，为正圆形态，自发分化组较诱导组早出现形态变化，D10出现周缘毛糙、松散，克隆中央尚致密，D14大多克隆变松散；而诱导组拟胚体在诱导D14开始出现周缘毛糙、松散，持续诱导至D21克隆中央仍较致密。

3.3 HUMSC-IPS体外向生殖方向分化关键基因表达

RT-PCR检测到HUMSC-IPS在体外生精微环境中培养，可以表达生殖分化关键基因SOX17和BLIMP1，且表达量随诱导时间变化而不同。在添加BMP4诱导组，SOX17基因表达量在第3天升高到达最高值，随后升高幅度减慢，在诱导14天后升高幅度明显减慢，在21天时仍高于对照组。BLIMP1基因的表达与SOX17基因表达变化趋势大体一致，呈规律性表达。见图2。

图1 IPS克隆边缘规整，细胞间连接紧密，生长在SCs饲养层上

图2 RT-PCR检测到生殖分化关键基因SOX17和BLIMP1表达增高，且随诱导时间变化而不同

4.讨论

不育不孕症是重要的现代社会和医学问题，生殖细胞移植是治疗不育症的理想途径。生殖细胞的发生是一个极其复杂的过程，其具体机制尚未完全清楚。研究表明通过类胚体形成、药物诱导和模拟生殖细胞生长环境均可诱导干细胞往生殖方向分化。诱导多能干细胞（IPS）是具有类似胚胎干细胞（ES）多能分化潜能的一类新型细胞，目前它越来越广泛的应用于基因治疗、药物筛选和细胞移植等领域[3]。人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（HUMSC）在分化程度上较为原始，受到疾病和环境造成的基因突变可能性极低，免疫原性低，取材来源广泛且安全无创[4]。本课题组前期已成功获得HUMSC来源的IPS细胞，且证实了HUMSC-IPS的无限自我更新能力和多胚层分化潜能[2]，并药物诱导其向生殖细胞方向分化做出了尝试。

随着研究的深入，人们发现精子的发生与睾丸微环境密切相关，在睾丸生精小管中提供微环境的唯一体细胞，是睾丸支持细胞（SCs）。SCs形成了生殖细胞发生、成长、获能所需要的结构支持、营养、内分泌因子环境，并通过构建血睾屏障形成局部免疫赦免来保护生殖细胞，维持生殖细胞通过减数分裂并最终发育出有功能的精子[5]。本实验通过丝裂霉素C处理纯化的新生小鼠睾丸SCs后，获得了失去分裂增值能力，但保留了细胞结构及分泌功能的SCs饲养细胞，可以为HUMSC-IPS向精原细胞分化提供立体接触表面及内分泌因子支持，形成生殖细胞分化所需的微环境。

原始生殖细胞（PGCs）是在胚胎时期出现的最早细胞类型，具有全能细胞的特性，是精子与卵子的前体细胞，是生殖细胞发育及配子产生的基础。SOX17和BLIMP1共同表达于PGCs中，靶向敲除SOX17后，发现多能基因及多种生殖细胞标记基因均出现表达的抑制，重新激活SOX17基因后，受抑制的相关基因表达量上升。SOX17是进入PGC阶段的关键调节因子，而BLIMP1则抑制内胚层和其他由SOX17和BMP信号通路诱导的成体细胞基因的表达。作为SOX17的下游基因，BLIMP1敲除后同样导致原始生殖细胞特化失败。[6,7]因此，SOX17及其下游基因BLIMP1对早期生殖细胞特化生成及功能维持至关重要。BMP4因子属于TGF—β家族，它通过激活SMAD家族的转录因子转导其信号通路并激活一系列的下游基因来发挥作用，可诱导外胚层细胞特化发育成PGCs。[8]

BMP4因子是否通过SOX17通路的激活，从而促使生殖细胞分化形成，我们设计了上述实验。我们通过HUMSC-IPS与SCs饲养层共培养，并添加细胞因子BMP4，体外模拟生殖细胞发生、发展需要的睾丸微环境，观察多能细胞向生殖细胞方向分化的过程。我们观察到，HUMSC-IPS在形态学上明显发生了变化，周缘毛糙、松散，逐渐出现精原细胞分化迹象。通过基因层面的表达分析，我们发现SOX17基因及其下游基因BLIMP1在我们的诱导体系下，均呈规律性高表达。本实验结果提示：（1）睾丸支持细胞构成的接触立体微环境，可以促进多能细胞向生殖细胞分化；（2）BMP4因子通过激活SOX17通路，来促使多能细胞特化发育成PGCs，从而向生殖细胞分化方向推进。

[1]Larson, K.L., et al. Sperm chromatin structure assay parameters as predictors of failed pregnancy following assisted reproductive techniques. Hum Reprod, 2000. 15(8): p.1717-22.

[2]杨汉华，etal.，六个转录因子将人脐带间充质干细胞高效重编程为诱导性多能干细胞的实验研究[J]中华实用儿科临床杂志，29，1331(2014).

[3]刘思征，马廉.诱导多能干细胞的研究进展[J].汕头大学医学院学报，2013，(3):173-175.

[4]Ma, L.,et al.Human umbilical cord Wharton's Jellyderived mesenchymal stem cells differentiation into nervelike cells.Chin Med J (Engl),2005.118(23):p.1987-93.

[5]Xie L，et a1．Sertoli cell—mediated differentiation of male germ cell-like cells from human umbilical cord Wharton’s jelly— derived mesenchymal stem cells in an in vitro co—culture system．Eur J Med Res，2015，20：9．

[6]Irie N,et al. SOX17 is a critical specifier of human primordialgerm cell fate[J].Cell,2015,160(1):253-268.

[7]Nakaki F,et al.Induction of mouse germcell fate by transcriptionfactors in vitro[J].Nature,2013,501(7466):222-226.

[8]Li, Y.and M.M.Parast,BMP4 regulation of human trophoblast development.Int J Dev Biol,2014.58(2-4):p.239-46.