润肤霜微生物限度检查方法研究

程龙 陈霞 熊雯

（成都市食品药品检验研究院 四川 成都 610045）

润肤霜（人参霜）是以人参皂苷为主要成分，辅以混合醇、单硬脂酸干油酯、液体石蜡、甘油、乳化剂、香精和防腐剂的局部给药制剂，可益气活血，促进皮肤代谢，用于治疗面部红斑、丘疹、干燥、脱屑等皮肤炎症。按照《中国药典》2015年版四部非无菌药品微生物限度标准规定，确定其标准为需氧菌总数每1g不得过102cfu，霉菌和酵母菌总数每1g不得过101cfu，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌每1g不得检出[1]。鉴于本品加入了防腐剂，对微生物的生长可能有一定的抑制作用，故本品在进行微生物限度检查时，应建立适合于本品的方法，消除样品的抑菌活性，建立可靠有效的方法[2,3,4]。

1.材料

1.1 仪器

超净工作台（苏净安泰）SW-CJ-2FD；生化培养箱（上海一恒科技）LRH-250；隔水式恒温培养箱（上海一恒科技）GHP-7290。

1.2 菌种

白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)631001]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]，均来源于中国药品生物制品检定所，均为第4代培养物。

1.3 培养基

胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、甘露醇氯化钠琼脂、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基和沙氏葡萄糖液体培养基（SDB），均由北京三药科技开发公司生产。

1.4 样品

润肤霜（某医院生产）

2.方法与结果

2.1 平皿法验证需氧菌总数计数

2.1.1 菌液制备 按照中国药典2015年版制备枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌及黑曲霉的菌悬液。

2.1.2 供试液制备 取本品10g，加含5%Tween-80的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，45℃水浴后用匀浆仪混匀，得1:10供试液。

2.1.3 回收率测定

供试品对照组：

取1:10供试液50mL，取1 mL分别注入2个平皿，共制备两组，测定供试品本底需氧菌以及霉菌和酵母菌总数；

菌液对照组：

分别取上述5种试验菌悬液0.5mL，加至50mL pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀，取1mL注入平皿，每株试验菌平行制备2个平皿，倾注TSA培养基，测定所加的试验菌数。

试验组：

分别取上述5种菌悬液0.5 mL，加至50ml的1:10供试液中，混匀，取1mL注入平皿，每株菌制备2个平皿，倾注TSA培养基。

分别取上述2种真菌悬液0.5mL，加至50ml的1:10供试液中，混匀，取1mL注入平皿，每株菌制备2个平皿，倾注SDA培养基。

如表1所示。

表1 常规法验证需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数试验结果（cfu/皿）

2.1.4 结果 从表1可以看出，取本品1:10供试液按平皿法进行计数时，TSA培养基中五种试验菌的回收率均在50%和200%之间，SDA培养基中两种真菌的回收率也在50%和200%之间。

2.2 控制菌检查方法的验证

2.2.1 金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检查

试验组：

取1:10供试液10ml及金黄色葡萄球菌悬液1ml加入到100ml的TSB中，35℃培养24小时。划线接种于甘露醇氯化钠平板上，培养后观察是否有菌生长。

取1:10供试液10ml及铜绿假单胞菌悬液1ml加入到100ml的TSB中，35℃培养24小时。划线接种于溴化十六烷基三甲铵平板上，培养后观察是否有菌生长。

阳性对照组：

取制备好的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌悬液1ml加入到100ml的TSB中，后续操作同上。

阴性对照组：

取10ml pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液加入到100ml的TSB中，后续操作同上。

供试品对照组：

取1:10供试液10ml加入到100ml的TSB中，后续操作同上。

表2 金黄色葡萄球菌检查方法验证结果

表3 铜绿假单胞菌检查方法验证结果

2.3.2 结果 由表2和3可知，阴性对照组和供试品对照组均未检出控制菌，阳性对照组和试验组均检出相应的控制菌，因此，本品金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检查可用常规法（TSB：100mL）。

3.讨论

本品在制备供试液的时溶解性较差，加入5%的吐温-80再水浴后，样品能较好溶解在其中，但本品为较粘稠的霜类，故需进一步用匀浆仪混匀，这样才能获得均质的供试液[5,6]。另外，本品的供试液有一定的粘附性，在用移液管或移液枪吸打供试液时，应缓慢操作，等待一段时间尽量使挂壁的供试液缓慢流下，以保证取样的准确性。

本品对细菌及真菌的抑制作用较小，微生物计数及控制菌检查均可采用常规法。根据验证结果将微生物限度检查方法记录如下：取本品10g，加含5%Tween-80的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，45℃水浴后用匀浆仪混匀，得1:10供试液。需氧菌总数以及霉菌和酵母菌总数计数可取1:10供试液按平皿法进行，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检查均可采用常规法（TSB：100mL）。

[1]国家药典委员会.中国人民共和国药典[s].北京：中国医药科技出版社，2015四部：140.

[2]杨晓莉，李辉，马英英等.中国药典2015年版非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法解读[J].药物分析杂志，2016，36（6）:1101-1107.

[3]杨晓莉，李辉，马英英，等.中国药典2015年版非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法解读与对策[J].中国药师，2016，19（4）:748-752.

[4]程龙，熊雯，陈霞.过敏康胶囊微生物限度检查的方法建立[J].中药与临床，2017，8（3）:38-41.

[5]胡泽锴，毛腾霄.抗敏止痒霜微生物限度检查方法研究[J].海峡药学，2016，28（11）:70-72.

[6]陈璐，汪洋，涂碎萍.抗痤霜微生物限度检查方法验证[J].国外医药抗生素分册，2016，37（6）:266-269.