四环素基因表达系统的研究进展

尚冰清

（徐州医科大学临床医学系院 江苏 徐州 221006）

基因的表达调控，涉及到多个因素的互相作用，是一个较为复杂的过程。在基因治疗中，如果对目的基因的表达时间和表达水平能进行精准调控，就能够有效的降低其副作用的发生率，提高治疗效果，为基因治疗提供重要的理论基础。一般来说，一个理想的可诱导表达系统具有以下特点：特异性、非干扰性、可诱导性、可逆性、剂量依赖性。目前，较为成熟的诱导表达系统有四环素诱导系统，蜕皮激素诱导表达系统，RU486诱导系统。其中四环素诱导调控系统应用最为广泛，本文简要回顾了其发展过程和应用研究。

1.四环素调控的基因表达系统的分子学机制

1.1 Tet调控系统

1992年，Gossen等最早建立了Tet-off基因调控系统，该系统是在大肠杆菌转座子Tn10中，以Tet阻遏因子(TetR)负性调控四环素操纵子为基础而建立的。含有调节质粒和反应质粒两部分(如图1.A)。调节质粒是一个四环素调控的转录因子(tTA)，由单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白中含有127个氨基酸的转录激活结构域(activation domain，AD)与含有207个氨基酸的四环素阻遏蛋白(TetR)融合而成。反应质粒包含目的基因和四环素反应元件(Ptet)。Ptet包含7个正向排列的Tet0 序列，含有TATA盒的多克隆位点在其下游，是巨细胞病毒的最小启动子(minimal CMV promoter，PminCMV)。因为该启动子缺乏增加子，无四环素(Tc)或者强力霉素(dox)不存在的情况下，tTA与Ptet特异性结合，目的基因得以表达。而Tc或dox可特异性结合tTA，分离tTA与Ptet，阻止下游转录。

图1.四环素调控系统

在1995年，Gossen等在tTA的结构基础上发现了它的反向突变体rtTA，建立了Tet-on调控系统(如图1.B)。rtTA与tTA有4个氨基酸发生了突变，与当有Tc存在时，rtTA才能与Ptet特异性结合，启动下游基因的表达。由于活体组织摄取Tc要比清楚快的多，因此在基因转录方面，Tet-on调控系统要比Tetoff调控系统迅速的多。

1.2 Tet调控系统的优点

Tet调控系统特异性强，且具有较高的诱导效率。特异性的原因尚不明确，猜测是由于四环素反应元件来自原核生物，而原核调节蛋白的DNA靶序在真核细胞中是不存在，故其靶序作用很特异。且不影响真核基因组表达。Tet系统在无诱导时，目的基因表达量低甚至无表达，四环素调控系统具有低背景表达和高水平诱导两大特点。此外，相比较于其他系统的诱导因子如激素、热休克，四环素作为抗生素，对细胞的毒害性较小。

Tet-off/Tet-on系统能够有效的控制目的基因表达，尤其是Tet-on系统。但该系统仍不够完善:rtTA的稳定性不能令人满意，在一些细胞内容易降解；更为重要的是基因泄露问题:在非诱导情况下，rtTA与tetO仍具有一定的结合率，诱导基因表达，致使目的基因的基础表达水平较高。

2.Tet调控系统的应用

随着不断研究和改进，四环素诱导表达调控系统可广泛应用于细胞的体外培养、转基因小鼠以及其他动物的诱导性基因表达研究中。诱导性基因表达系统可以在时间上调控基因的表达，作为基因功能研究重要工具之一。其中的四环素诱导的基因表达系统，是应用最广泛的一种。在此基础上相继建立了双向启动子调控的转基因表达系统、与四环素控制的转录沉默系统（tTS）以及Cre/loxP系统结合的诱导性条件性基因敲除系统，它们在研究哺乳动物基因的功能及表达调控方面发挥了重要作用[1-2]。

其中，它在基因治疗方面的研究得到了广泛的关注。

通过tet调控系统来调节GDNF表达来治疗帕金森氏病，该系统将会适时决定关闭基因表达或调控基因表达来阻止由于细胞异常增殖带来的不良副作用，如细胞连接错误，或释放出的异常神经递质。2009年，Manfredsson等成功验证了rAAV-TetOff载体在大鼠脑中的有效调控。相对于病毒载体来说，tet调控系统仅需较小的诱导剂量，当dox浓度为0.3μg/ml时，GDNF的表达完全消失[3]。然而有研究[4]表明，由于血脑屏障的存在，需要维持较高的血浆 dox浓度而相对较低脑脊液（CSF）来诱导大脑中rtTA2S-M2驱动的转基因表达。应该避免长期高剂量的dox的毒副作用，因此，在较低dox水平下更活跃的新rtTA变体是可取的。

有研究[5]表明，通过构建的以DNA载体介导的能够高效调控siRNA沉默基因效应的Tet-On基因表达系统，能够促进其在更多模型系统中进行基因功能研究的应用。通过构建DNA载体介导的小干扰RNA(siRNA)Tet-on表达载体，pDIRS4.1 siRNA。随着Dox浓度升高，pDIRS4.1 siRNA载体在人成骨肉瘤细胞中对目的基因的沉默作用有较好的调控性，且目的基因的表达与Dox具有严格的剂量依赖关系，高浓度Dox时，IL-6表达水平降低约12倍。

此外，有研究[6]表明，通过构建携带四环素真核诱导表达系统(Tet-on)调控的人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)，可为骨缺损修复提供可控的成骨活性细胞。构建携带可调控系统的感染293T细胞后获得hBMP-2-GV347慢病毒浓缩液，在DOX诱导下转染后的BMSC细胞增殖能力较普通BMSC强，并在DOX浓度为10μg/ml诱导下稳定表达BMP-2蛋白和RNA。

Tet生物功能和催化机制的研究将有助于深入了解与DNA去甲基化途径相关肿瘤的发生和发展机制，同时也为研发全新的抗肿瘤靶向药物提供参考。

基因治疗的目的：是为当前尚无完善的治疗方案的疾病提供更为合适的治疗方法。目前，国际上已在临床上试行的基因治疗超过300例，包括恶性肿瘤、神经性疾病、心血管疾病、感染性疾病和眼病等。迄今为止，已经利用腺病毒载体或者逆转录病毒载体在I、Ⅱ和Ⅲ期临床实验中来治疗恶性胶质瘤。

四环素基因调控系统是目前应用最广的调控系统，已被用于多种载体中，已经被编码在慢病毒属、腺病毒属、腺相关病毒属和逆转录病毒属，而且可以有效地对基因进行调控，这增加了Tet系统在不同器官中应用的可能性。为增强其安全性，还需继续对调控的严密性和特异性进行进一步的改进和发展。

[1]Shetty D K．Shetty R，Inamdar M S.Generation of OCIADl inducible overexpression human embryonic stemcellline:BJN-hem20-OCIADl-Tet-On[J].Stem Cell Res，2016，16(2)：246-248．

[2]Yao M，Lu X，Lei Y，et a1．Conditional inducible tripletrans-genic mouse model for rapid real-time detection of HCV NS3/4A protease activity[J]．PLoS One，2016，11(3)：e0150894．

[3]Manfredsson FP, Burger C, Rising AC, et al.Tight Longterm dynamic doxycycline responsive nigrostriatal GDNF using a single rAAV vector[J].MolTher 2009;17(11):1857-67.

[4]Centlivre M, Zhou X, Pouw SM, et al.Autoregulatory lentiviral vectors allow multiple cycles of doxycyclineinducible gene expression in human hematopoietic cells in vivo [J].Gene Ther 2010; 17(1): 14-25.

[5]李朵璐，周玉冰，韩超，et al.DNA载体介导的小干扰RNA Teton基因表达系统的调控效应检测[J].中国现代医学杂志，2017，7;30-35.

[6]白波黄弘轩黄芳立，et al.人骨形态蛋白-2可调控系统在大鼠骨髓间充质干细胞的表达[J].中华关节外科杂志（电子版），2017，6; 622-628.