艾灸对FCA诱导的AA模型大鼠心肌超微结构及血清代谢组学的影响

朱 艳，俞红五，潘喻珍，杨 佳，吴炳坤，胡 雪，曹云燕

（安徽中医药大学第二附属医院老年病科，合肥 230061）

类风湿关节炎（RA）是一种可以影响全身的自身免疫性疾病，病变不仅引起关节炎症，还可引起肺、心等重要脏器的损伤，其中RA造成的心血管系统损伤为正常人群的3～4倍，甚至有人提出RA和糖尿病一样可作为心血管疾病的独立危险因素[1-3]。艾灸作为祖国医学中最为常用的外治方法，可以温经通络、活血化瘀，以改善全身及局部的血液循环，促进机体的新陈代谢，从而扶正祛邪，有效的治疗疾病[4]。本研究通过代谢组学方法寻找艾灸调节RA的标志性代谢产物及其代谢通路，以明确相关物质的变化趋势，初步探索艾灸干预RA作用机制，为RA治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级Wistar雄性大鼠80只，体质量（180±30）g，鼠龄5～6月，由南京生物医药研究院提供，动物合格证号：SCXF（苏）2015-0001。实验室保持恒定的温度和湿度，大鼠在明暗时间为12/12 h（明期7:00～19:00）条件下进行饲养。本实验通过动物伦理委员会批准。

1.2 仪器、试剂及药品 FCA购自美国SIGMA公司；TPT：10 mg/片，上海复旦复华药业有限公司；特制香烟型纯艾条（直径1 cm，南阳市卧龙汉医艾绒厂）。仪器：美国安捷伦公司GC/MS，型号为7890A/5975C。

1.3 造模方法 采用风、寒、湿环境因素+生物因子复合造模方法[4]复制AA模型。所有除了NC组以外的大鼠均放入造模环境中20 d。于第21天在大鼠右后足跖部注射FCA 0.5 mL/只，致炎，以建立AA模型。然后观察3 d，其中以24 h后见足踝部急性炎性肿胀，以48 h见对侧肢体或前肢，甚至尾部、耳朵炎性结节或红肿出现示造模成功。

1.4 分组及治疗 将大鼠分为NC组20只，造模成功的大鼠按随机数字表随机分为MC 20只、TPT组20只和艾灸组20只。艾灸组：参照文献[5]选取肾俞、足三里穴，按照大鼠穴位图谱定位穴区，剪去各穴位置区域的被毛，标记为红色。造模成功3 d后，予艾条在距穴位2 cm处悬灸；治疗时，1次/d，选1穴，2穴交替使用，20 min/次，连续治疗15 d。TPT组：以TPT溶液灌胃，按照8 mg/（kg·d）剂量，1次/d，共15 d[6]。NC组和MC组：予以生理盐水灌胃。

1.5 检测指标及方法 1）关节肿胀度测量[5]：分别在造模前1 d、造模后3 d、最后1次治疗24 h量取各组每只大鼠的右侧后足跖的容积，以算取每个大鼠的足跖肿胀度。2）AI测定[7]：分别在造模前 1 d、造模后3 d、最后1次治疗24 h评估全身各个关节病变的程度。根据5级评分法进行评价，依据右后肢体外的其余3个肢体的病变程度来累积积分，从而计算出AI。计分标准为0分：无红肿；1分：小趾关节红肿；2分：趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。把每个关节积分相加即得每只大鼠的AI。3）电镜观察 ：在最后1次治疗24 h后每组取7只大鼠，用戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉大鼠后开胸取出心脏，留取左心室游离壁中层的心肌组织，切成1 mm3的小块（在冰上操作），立即放于装有戊二醛的缓冲液中，于4 ℃，固定2 h以上，用磷酸缓冲液浸洗约30 min，然后用四氧化锇固定液在4 ℃固定2 h，再以磷酸缓冲液浸泡冲洗，然后选乙醇梯度进行脱水，再以环氧树脂Epon 812 浸透、然后包埋，美兰染色后在光学显微镜下定位，以超薄切片机切成超薄片，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，最后在透射电镜下观察、拍照。4）代谢组学检测：血清代谢组学检测，最后1次治疗24 h后，每组取5只大鼠，取每只大鼠全血2 mL放在普通生化管内，然后离心以3 000 r/min 速度持续10 min，吸取上层血清，储存于- 80 ℃冰箱内以进行代谢组学检测。在配置血清样品时，取两倍体积的填酸盐缓冲液和一份血清混合，以抵消pH对化学位移的影响，然后加入适量Dss用作化学位移零点的定标。在配好后滴进5 mm样品管并于Vari-an Unity plus 500 MHz谱仪上进行釆集样品的一维'H-NMR谱图。该实验选用5 mmHCN三共振探头，300 K的温度，5 kHz的谱宽，信号共累加256次，釆样点数为16 k，釆样NOEPR-CPMG脉冲序列，其中抑制水峰信号选用预饱和脉冲序列，抑制由蛋白和脂蛋白等产生的宽峰，采用CPMG自旋回波序列从而得到窄的谱线。谱图预处理，用自编软件和MestRe-C 2. 3软件对谱图实行谱峰对齐、基线校正以及手动调相。对在50.2～4.6区域范围内的则行自适应积分，选用Pareto标度化对数据进行预处理后；然后对积分数据归一化以构成数据矩阵，进行PCA和PLS-DA方法被选用对数据矩阵行统计分析。采用载荷图和得分图以分析结果并表示分析所得结果。

1.6 统计学方法 寻找差异性代谢物最常用的方法之一是PLS-DA分析[8]。依据其变量重要性投影（VIP）＞1为阈值提示是有差异的代谢物。采用SPSS 17. 0统计软件，考察代谢物含量差异的显著性采用单因素方差分析，组间单维P检验多维统计结果采用t检验，其中P＜0.05表示有统计学意义。若同时满足单维统计P＜0.05和VIP＞1的代谢物才是最终差异代谢物[9]。

2 结果

2.1 4组大鼠关节足跖肿胀度和AI的比较 见表1。

表1 4组大鼠足跖肿胀度和AI的比较（，n = 20）

表1 4组大鼠足跖肿胀度和AI的比较（，n = 20）

注：与NC组比较，## P＜0.01；与MC组比较，△△P＜0.01；与艾灸组比较，▲P＜0.05

指 标 NC组 MC组 TPT组 艾灸组致炎前1 d足跖肿胀度/% 1.81±0.19 1.80±0.17 1.79±0.12 1.82±0.11致炎后3 d足跖肿胀度/% 1.89±0.13 3.03±0.12## 2.91±0.17## 2.94±0.16##致炎后18 d足跖肿胀度/% 1.91±0.23 2.62±0.07## 2.42±0.09△△ 2.32±0.10△△致炎后 3 d AI 值 /分 0 9.31±0.76## 9.36±1.05## 9.20±01.07##致炎后18 d AI 值/分 0 6.79±1.19## 4.61±0.91△△▲ 3.57±0.89△△

2.2 病理学结果 NC组大鼠线粒体膜边界清晰，嵴纵行排列密集有规律，横纹排列清晰有序；MC组大鼠的线粒体膜边界不清，肿胀明显，嵴稀疏，横纹大部分消失，体内大部分呈空泡状态；TPT组大鼠线粒体轻度肿胀，有轻度空泡化，嵴和横纹排列轻度紊乱但尚清楚；艾灸组大鼠线粒体呈椭圆形或长方形排列于肌纤维间，略肿胀，膜尚清晰，嵴和横纹分布基本整齐有序。

2.3 血清样本的总离子流色谱图（TIC） 见图1。肉眼可见的每个 TIC 图上的色谱峰下可能包含若干个共流出峰，数据复杂。大量的色谱峰均被GC/MS从每个样本中检测到。采用软件算法对采集到的质谱数据进行预处理分析，将复杂的质谱信号转化成有用定性定量数据。同时，在以下分析中选用多维统计和单维统计相结合的方法来获取组学特征，以表征群体之间的代谢特征。

2.4 PCA 轮廓分析 PCA 模型常用于真实地反映各组间的差异，但是由于代谢组较基因组、转录组和蛋白质组过于灵敏，因此受到遗传背景和环境干扰的影响比基因组、转录组和蛋白质组要大，如果组间差异较小，这个模型对于哺乳动物来说，通常无效。为了消除这种影响，通常采用监督性模型，如PLS-DA。用模型质量参数R2X（X 模型的解释率）、R2Y（Y观察量即组间差异的解释率）、Q2（预测率）来表示模型质量。一般来说，它们的值大于 0.5，即表示模型质量较好[10]，血清组PCA-X4个主成分R2X =0.52；因此，用2种PCA法建立的模型具有较高稳定性。

2.5 PLS-DA 从各组血清PLS-DA得分图可知，以模型的可解释指标R2X和可预测指标Q2，血清PLS-DA 2个主成分 R2X = 0.24，R2Y = 0.594，Q2 = 0.161。结果提示，所建立的数学模型比较可靠，说明组间代谢组的差异比较显著。

图1 血清样本的总离子流色谱图（TIC）

2.6 血清中潜在的生物标志物信息 见表2。MC组较NC组的变化主要体现于葡萄糖、丙氨酸、鸟氨酸、蔗糖低下，对甲酚、花生四烯酸增强；艾灸组的变化较MC组的变化主要体现于葡萄糖增强，对甲酚减低；TPT组的变化较MC组的变化主要体现于葡萄糖和丙氨酸增强，对甲酚和花生四烯酸减低；TPT组的变化较艾灸组的变化主要体现于葡萄糖、丙氨酸、鸟氨酸、蔗糖低下，对甲酚增强。

表2 血清中潜在的生物标志物信息

3 讨论

艾灸为传统的中医外治方面，艾灸的继承与发扬，需要现代先进的科学方法与技术的诠释。代谢组学是一种具有整体水平的研究方法，符合中医整体观和阴阳动态平衡观，又与艾灸能够整体性调节机体的作用相契合。因此，采用代谢组学方法深入的对艾灸治疗RA作用机制进行探讨符合研究的实际需要，将有利于系统地阐释艾灸治疗RA的作用机制，同时推动艾灸疗法在临床中的运用。

本研究从AA大鼠血液代谢组学中发现，变化过程的代谢标志物为葡萄糖、丙氨酸、鸟氨酸、对甲酚、花生四烯酸、蔗糖，其中扰动的代谢通路主要涉及：糖类代谢、氨基酸代谢、肠内菌群及脂肪酸代谢。

脂肪、蛋白质和糖类为体内三大营养物质，与能量代谢密切相关。糖代谢具体包括糖酵解、有氧氧化等代谢途径，即能提供能量为机体，又可以通过信号通路或网络来调节机体的生理机能。研究[11-12]发现，糖酵解与RA的发病机制及疾病进展密切相关，并认为RA中糖代谢活动增强从而导致相关基因的表达异常。

鸟氨酸是由精氨酸分解而来，而精氨酸是通过一氧化氮途径来发挥免疫调节作用，使免疫球蛋白产生从而在机体免疫方面起重要作用[13]。丙氨酸是葡萄糖形成过程当中的主要物质，而丙氨酸与葡萄糖还构成一个循环即丙氨酸-葡萄糖循环，因此，机体从血液中吸收大量丙氨酸来促进糖代谢为机体供能，从而加强自身免疫[14]。

众所周知，许多免疫活性细胞参与RA的发病，前列腺素E2是非常重要的致炎因子、且是花生四烯酸的代谢产物。而花生四烯酸又是白三烯的前体，白三烯B4与动脉粥样硬化有关[15]，同时是体内非常重要的炎症反应调节因子，它不仅能够激活多种炎性和免疫效应细胞而且能够聚集上述细胞。现代研究[17]发现，RA患者体内白三烯B4的浓度明显升高，与关节肿痛、关节破坏密切相关[16]。

对甲苯酚是苯丙氨酸于肠内在厌氧菌群的作用下产生，在AA大鼠血清中发现该物质，说明了AA大鼠体内肠道菌群代谢发生扰动。

本实验结果亦发现，AA大鼠血清中葡萄糖、丙氨酸、鸟氨酸、蔗糖低下，对甲酚、花生四烯酸增强；经艾灸干预后葡萄糖增强，对甲酚减低；说明艾灸参与了糖类、肠道菌群及脂肪酸的代谢。而相较于TPT组来说，艾灸组葡萄糖、丙氨酸、鸟氨酸、蔗糖增强，对甲酚低下，说明艾灸亦参与了氨基酸代谢。

由上可见，艾灸能明显改善RA炎症反应，同时能够保护心肌，调控氨基酸、脂肪酸代谢及肠内菌群代谢可能是艾灸治疗RA的特异性体现。

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