针刺预处理对大鼠缺血心肌线粒体通透孔开放的调节

宋春华，丁 续，王保叶，付嘉明，徐红飞，公维志，董勤建，李晓艳，郭丹丹，金艳红，闫 珺，亢连茹

（1.黑龙江中医药大学， 哈尔滨 150040 ；2.仪陇县人民医院，四川 南充 637600 ）

目前，心血管病发病率呈逐年上升趋势，约有1 700万人每年死于该病[1]，成为危害健康三大杀手之一[2]。减少其发生、降低患者病死率、提高生存质量是目前本病研究的方向[3-4]。MIRI发生时线粒体膜结构和功能发生改变，与mPTP等关系密切。本文为针刺心俞预处理调节mPTP开放的相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料 动物 ：Wistar雄性大鼠96只（青岛派特福德白鼠养殖专业合作社）。体质量210 g。试剂：上海华蓝化科公司 1%伊文思蓝及2，3，5-氯化三苯基四氮唑、上海宝曼科公mPTP荧光检测试剂盒。中生北控公司DAB显色试剂盒、鼠抗多克隆一抗、PV6002。仪器：北京众实迪创科技Kent ScientificA03-003型小动物呼吸机 、日本OLYMPUS公司激光共聚焦显微镜LSM510、美国Media Cybernetic公司Image-Pro Plus图像分析软件、中国尤尼柯公司紫外分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 禁食12 h，自由饮水。随机分空白、模型、实验、对照组，每组分即刻、24 h、48 h组。除空白组，其他组各时间组结扎法 MIRI造模后取材。空白组：造模前固定30 min不处理；1次/d，连续15 d，不造模。模型组：造模前同空白组；MIRI造模。实验组：造膜前15 d针刺；1次/d，30 min/次，共15 d。对照组：造模前同空白组；造模时，冠脉结扎前先阻断血流5 min，再灌流5 min；连续重复3次，缺血预处理30 min。

1.2.2 穴位定位及针刺预处理方法 心俞定位根据《实验针灸学》穴位图谱。操作：1）心俞：T5棘突下旁开约7 mm；直刺0.3～0.4 cm接G6805-Ⅱ电针；2）参数：频率20 Hz，电压3 V，连续波；3）强度：大鼠出现与电针同频率轻微颤抖为宜。连续15 d针刺（电针）。

1.2.3 MIRI/缺血预处理动物模型的制作 参照文献[5-10]传统方法进行。

1.2.4 激光共聚焦检测

1.2.4.1 mPTP检测原理 采用活体细胞mPTP荧光检测盒，观察线粒体通透孔：线粒体内荧光的强度高为线粒体完好，膜通透孔呈关闭状态，反之表明线粒体破坏，膜通透孔开放状态。

1.2.4.2 mPTP检测步骤 1）把心肌细胞悬浮液移到离心管，放置离心机，速度为2 000 r/min，离心5 min。2）取出离心管之上清液，加100 μL 清理液Reagent A（37 ℃），充分反应之完全分离细胞；把液体再离心，方式同1）。3）取上清液，分别加进100 μL染色液Reagent B和中和液Reagent C，把离心管内细胞充分染色，放至37 ℃细胞培养箱20 min充分染色，避光，离心同1）。4）抽弃上清液，加进100 μL Reagent A清理液（37 ℃），清洗细胞；离心同1）；弃上清液。5）重复实验步骤同4）。6）加进100 μL清理液Reagent A（37 ℃），清洗细胞。7） LSCM观察：移液枪取10 μL离心管内液体，均匀涂至载波片，盖盖玻片，放至LSCM下。启动LSCM，参数激发波长488 nm，散发波长505 nm观察心肌细胞mPTP开放。

1.2.5 凋亡相关蛋白表达 空白组及模型组每日不处理，对照组处理同1.2.1，实验组每日电针心俞，连续15 d，第15天治疗后 30 min 造模，6 h后取心肌组织，免疫组化法观察C凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2 表达。每只大鼠取 2 张切片，每张切片取 5 个连续不重复视野。以10 个视野阳性C数平均值记数。200 倍光镜下统计Caspase-3、Bcl-2阳性C数。

1.3 统计学方法 用SPSS 19.0 统计软件处理，实验数据用均数±标准差（）表示。正态性检验数据，多组组间比较用单因素方差。组间比较方差齐用LSD法检验，方差不齐用Tamhane’s T2法检验。

2 结果

2.1 不同时间组mPTP荧光强度比较 见表1。

表1 不同时间组mPTP荧光强度比较（ ，n = 24）

表1 不同时间组mPTP荧光强度比较（ ，n = 24）

注：与空白组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与实验组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组 别 即刻组 24 h组 48 h组空白组 51.19±2.13 52.29±1.98 50.12±1.68模型组 21.36±1.82# 22.23±1.78# 23.01±1.84#实验组 31.16±1.30△ 43.35±2.02△△ 37.68±2.01△对照组 31.13±1.40 30.46±1.54▲▲ 29.85±1.15▲

2.2 Caspase-3及Bcl-2表达的阳性细胞数 见表2。

表2 Caspase-3及Bcl-2蛋白表达的阳性细胞数（ ，n = 24） ‰

表2 Caspase-3及Bcl-2蛋白表达的阳性细胞数（ ，n = 24） ‰

注：与模型组比较，## P＜0.01； 与对照组比较，△△P＜0.01

组 别 bcl-2 caspase-3空白组 153.83±19.21 116.82±8.74模型组 46.78±16.34 354.45±22.32△△实验组 298.37±49.18##△△ 154.28±21.03##△△对照组 189.93±45.24## 227.24±17.32##

研究表明，4组不同时间对mPTP均有影响。实验不同时相MIRI心肌C mPTP开放程度不同。从表1可看出：1）荧光强度比较，模型组最弱，缺血程度相对最重（P＜0.05）；2）与模型组比较实验各组荧光强度均升高（P＜0.01，P＜0.05）；3）实验组即刻较对照组荧光强度无统计学意义（P＞0.05），实验组24、48 h较对照组差异显著（P＜0.01，P＜0.05）。

实验表明，对照组与实验组均抑制mPTP开放，且调控作用24 h最好，48 h相对良好。实验组下调 Caspase-3 及上调Bcl-2 表达明显优于对照组。说明电针心俞预处理可能通过调整mPTP开放，下调Caspase-3 、上调Bcl-2 表达而保护缺血心肌的。

3 讨论

mPTP被称为最重要抑制细胞凋亡孔道[11]。mPTP存在于线粒体膜上，确保线粒体内外理化因子和生物活性物通过；C失活后，各种凋亡因子刺激其失活性开放，使得线粒体肿胀变形等，心肌功能障碍，最终心肌坏死。LSCM[12]是当前研究mPTP最有效方法之一。本研究用LSCM分析mPTP开闭程度，观察电针心俞预处理防控缺血心脏病机制[13]。

中医学认为，心俞为心之背俞，为治疗心脏疾病要穴。针刺可调心脉气血，通调阴阳，心脏得到精气濡养，气血充盛，邪不可干。从解剖学看，心脏相关神经布于心俞处，电针及预处理心俞可一定程度改善急性心肌缺血[14-15]；减轻心肌损伤，抑制线粒体凋亡，控制mPTP开放[16]，对心肌有保护作用。

本研究结果证实，实验组对缺血不同时间心肌保护作用有差异，且随时间改变呈增强-峰值-减弱趋势；实验24 h组可能为最佳治疗时间；实验组下调 Caspase-3及上调Bcl-2 蛋白表达明显优于对照组。电针预处理心俞保护MIRI损伤心肌作用，其机制可能通过调控相关基因蛋白及mPTP开放，减少凋亡实现的。

：

[1]何华.干细胞治疗缺血性心脏病的临床研究进展[J].心血管病学进展, 2012, 33(2):181-184.

[2]许荣,王宁,王晓明.自噬在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展[J].中华老年心脑血管病杂志, 2015, 12(12):1327.

[3] HERLITZ J, WOGNSEN G B, EMANUELSSON H, et al.Mortality and morbidity in diabetic and nondiabetic patients during a 2-year period after coronary artery bypass grafting[J].Diabetes Care, 1996, 19(7):698-703.

[4]HE Ben, ZHAO Yichao, XU Longwei, et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia/reperfusion injury[J]. Journal of Pineal Research, 2016, 60(3):313-326.

[5]张超越,赵龙,徐京育.芪桂益脉灵对急性心肌缺血再灌注损伤保护机制的研究[J].吉林中医药, 2017, 37(1):67-71.

[6]王俊东,崔勇,王建国.人参皂苷Rh3预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中caspase-3的作用[J].长春中医药大学学报, 2017, 33(1):13-15.

[7]白桦,卢圣锋,陈婉莹,等.顾一煌麦粒灸预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤不同时期保护效应及Beclin 1表达的影响[J].针刺研究, 2017, 42(6):471-476.

[8]黄婷,李绍旦,李涵,等.通心络干预肥大细胞脱颗粒诱导的炎症反应对缺血再灌注心肌的保护机制[J].中西医结合心脑血管病杂志, 2017, 15(23):2973-2976.

[9]周淑妮,郭浩.温阳通络中药联合磷酸肌酸钠治疗老年缺血性心肌病继发心力衰竭疗效及对BNP, Hcy水平的影响[J].现代中西医结合杂志, 2018, 27(1):92-95.

[10]袁渊,蒲清荣,黄锐,等.丹参饮对冠脉结扎大鼠心肌缺血的保护研究[J].现代药物与临床, 2017, 32(12):2299.

[11] DJC organizer, J goode. mitochondrialion channels in cardiac function and dysfunction[J]. John Wiley, 2008, 287(287):140-156.

[12]游雪娇,李良秋,马连营,等.激光共聚焦扫描显微镜在抗菌机理研究中的应用[J].微生物学通报, 2015,10(6):1108-1121.

[13] MINSKY M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope[J]. Scanning, 1988(10):128-138.

[14]谭成富,严洁,王超,等.针灸预处理对心肌缺血再灌注损伤兔不同时间热休克蛋白27, 70, 90表达的影响[J].针刺研究, 2017, 42(1):31-38.

[15]王静,刘玺芳,富宏然,等.电针心俞穴对家兔急性心肌缺血保护作用的研究[J].针灸临床杂志, 2015, 31(1):68-70.

[16]郭俐宏,陈德森,方伟,等.电针内关心俞对大鼠急性心肌缺血的保护作用[J].针灸临床杂志, 2009, 25(11):45.