不同时段尿标本检测巨细胞病毒在小儿人巨细胞病毒感染中的应用

黄斌 刘素云 万丽佳 刘明 吴小秧 罗勤

[摘要]目的 对荧光定量PCR法在人巨细胞病毒感染患儿不同时段尿标本检测巨细胞病毒中的应用效果进行探讨。方法 选取2015年9月～2017年2月我院儿科收治的30例人巨细胞病毒感染患儿，所有患儿分别于清晨采集晨尿作为晨尿组，于其他时段采集尿液标本作为随机时段组，应用实时荧光定量PCR技术对不同时段尿标本人巨细胞病毒DNA水平进行检查，对比两组阳性检出率。结果 晨尿组，27例检出人巨细胞病毒阳性，检出率为90.00%，随机时段组，20例检出人巨细胞病毒阳性，检出率66.67%，晨尿组明显高于随机时段组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 对人巨细胞病毒感染患儿应用实时荧光定量PCR技术检测巨细胞病毒，采集患儿晨尿作为检测标本，阳性检出率较高，可有效降低漏诊情况，在临床中值得推广应用。

[关键词]人巨细胞病毒；小儿；实时荧光定量PCR；不同时段

[中图分类号] R446.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）4（c）-0119-03

Detection of cytomegalovirus in children with cytomegalovirus infection by urine samples at different time intervals

HUANG Bin LIU Su-yun WAN Li-jia LIU Ming WU Xiao-yang LUO Qin

Department of Pediatrics，People′s Hospital of Pingxiang City，Jiangxi Province，Pingxiang 337000，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of fluorescent quantitative PCR in detection of cytomegalovirus （HCMV） in urine samples of children with HCMV infection at different time intervals.Methods A total of 30 cases of infection in our hospital from September 2015 to February 2017 in Department of Pediatrics of infected children，for all children were collected in the morning urine as morning urine group，collecting urine specimens as random specimens from other time periods，the application of real-time fluorescence quantitative PCR technology in different periods of urine HCMV DNA level standard for examination，the positive detection rate was compared between the two groups.Results The results showed that morning urine group，27 cases were detected HCMV positive，the detection rate of 90.00%，random time urine group，20 cases were detected HCMV positive，the detection rate of 66.67%，compared the two groups，morning urine group was significantly higher than that of random time group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion The detection of HCMV real-time fluorescent quantitative PCR in children with infection of HCMV in children，collection of morning urine samples for testing，the positive rate is high，effectively reduce the misdiagnosis，it is worth in clinical application.

[Key words]Human cytomegalovirus；Children；Real-time quantitative PCR；Different periods

巨細胞病毒感染是由人巨细胞病毒（human cytom-egalovirus，HCMV）引起的人类感染性疾病。HCMV一旦侵入体内，将长期或终身存在体内，在绝大多数免疫正常个体，常成无症状感染，但在免疫抑制个体，新生儿及婴幼儿可出现明显病症，表现为肝炎、肺炎、脑膜脑炎、智力低下和先天性耳聋等。HCMV可从宿主尿液、血液及呼吸道分泌物等多个部位排出，国内外已广泛进行血尿痰等不同标本的检测[1-2]，尿液标本因其阳性率较高[3]、无创伤，易为患儿及家属所接受。目前国内外已有晨尿标本检测HCMV-DNA水平的相关报道[4]，但新生儿及婴幼儿因其排尿控制较困难，有时需采集其他时段随机尿标本。本研究通过对不同时段尿应用实时荧光定量PCR技术检测HCMV-DNA水平，比较晨尿与随机时段尿的HCMV阳性检出率，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2015年9月～2017年2月我院儿科收治的30例HCMV感染患儿，其中，男16例，女14例；年龄34 h～1岁，平均（6.5±2.7）个月。所有患儿分别于清晨采集晨尿作为晨尿组，于其他时段采集尿液作为随机时段组。所有患儿均符合《巨细胞病毒感染诊断方案》中诊断标准，经我院医学伦理委员会批准，患儿家属对本研究知情，且签署知情同意书。其中下呼吸道感染25例，高胆红素血症2例，肠炎3例，部分病例病程较长。

1.2方法

标本采集：晨尿组患儿于清晨6时采集患儿晨尿，随机时段尿组患儿当天任意时间内采集患儿尿标本。仪器试剂：采用ABI7300型荧光定量PCR仪（美国）检测HCMV，核酸扩增荧光定量检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司）。检测方法：将采集到的尿液标本轻轻颠倒摇匀，用加样枪吸出100 μl，取离心管，装入DNA浓缩液100 μl，将吸出的尿液标本一并加入，振荡摇匀，在离心机上按12000 r速率离心10 min，将上清液去除，将DNA提取液20 μl加入到剩余的沉淀物中打匀，然后进行瞬时离心数秒，在100℃条件下保温10 min，再行12000 r速率离心5 min，然后取出2 μl上清液做PCR扩增。

1.3判断标准

阳性：HCMV-DNA呈典型S型增长曲线，试验定量结果>500 copies/ml；阴性：不符合阳性判断标准即为阴性。

1.4统计学方法

采用统计学软件SPSS 19.0分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

通过对不同时段患儿尿采用实时荧光定量PCR技术检测，结果显示，晨尿组，阳性检出率为90.00%，随机时段组，阳性检出率为66.67%，两组比较，晨尿组阳性检出率明显高于随机时段组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 两组患儿阳性检出结果的比较

3讨论

HCMV感染是由HCMV引起的人类感染性疾病。我国是HCMV感染的高发区，平均感染率高达80%～90%[5]。HCMV一旦侵入体内，将长期或终身存在体内，在绝大多数免疫正常个体，常成无症状感染，但在免疫抑制个体，新生儿及婴幼儿可出现明显病症，表现为肝炎、肺炎、脑膜脑炎、智力低下和先天性耳聋等。HCMV可从宿主尿液、血液及呼吸道分泌物等多个部位排出，国内外已广泛进行血尿痰等不同标本的检测，尿液标本因其阳性率较高、无创伤，易为患儿及家属所接受。

HCMV属双链DNA病毒，仅在人和人间传播，具有高度的种属特异性，其生物学特征表现为潜伏-活化，婴幼儿活动性HCMV感染会造成终末器官病变，以肝炎肺炎等为主要表現形式，在对患儿治疗时，及早对小儿HCMV感染准确、快速、便捷的诊断，能为临床治疗提供可靠的依据[6]。现阶段，HCMV感染诊断中，主要依靠实验室检查，包含血清特异性抗体检测、病毒培养、抗原血症检测、DNA的PCR检测、组织病理学检测及CMV-RNA检测等。而现阶段比较推崇的检测方法为CMV-DNA定量检测，通过对荧光信号积累，对PCR进程实时监测，从而实现定量分析的目的。而在对不同标本检测时，标本的采集时间对检测结果也会带来较大的影响。

尿液检查是当前临床检查中重要的检查项目之一，应用范围非常广泛，有利于医生对疾病进行判断，掌握患者的病情，并且作为检测的标本，尿液取材更加方便，PCR定量检测结果更加准确，在HCMV感染动态观察中，以尿液作为检验标本应用效果更好[8]。为了使尿检有效性得到提高，全自动尿沉渣分析仪在尿检中的应用越来越多，有效提高了尿检速度的同时，尿检效率也得到提高。而影响尿检结果准确性的因素有很多，包含尿液采集时间、检验时间及容器污染等因素，都会导致检验结果出现差异[9-10]。本研究结果显示，晨尿组阳性检出率达到90.00%，而随机时段组阳性检出率仅为66.67%，提示尿液标本采集时间段的不同，对检测结果的影响非常大。之所以选择晨尿，即清晨起床后空腹状态下首次排除的尿液，究其原因，主要是由于人在经过一夜的睡眠后，清晨首次晨尿在人体内会经过浓缩后发生酸化，在酸性环境中，尿液内上皮细胞、血细胞及管型等有形成分更为稳定；并且清晨尚未进食，尿液成分不会受到饮食的影响，保证了化学成分测定的准确性[11-12]；反之，采集随机时段尿液标本时，患儿随时排尿使得体内尿液不会聚集发生酸化，并且经过运动、饮食等因素的影响，尿液中各种检测指标也变得分散、稀释，反映在检验结果中，就会出现结果准确性下降的情况，如餐后尿，因此时机体的代谢比较旺盛，肾血流量增大，白细胞边缘池进入循环池，病理成分也有所增加[13-14]。所以尿液中的细胞含量相对较高，由于随机尿不受时间的限制，所以在急诊与门诊患儿尿液筛查中更为适合，标本也比较新鲜，容易获取，但所采集的尿液标本只能对一段时间内患者机体的情况进行反映，容易受多种因素的影响，导致病理临界物质浓度降低，出现漏诊情况[15]。也有研究认为，晨尿在膀胱内存留的时间过程，尿液中的葡萄糖及硝酸盐等成分容易被分解，对在酸性环境中容易改变的物质不易被检测出来，所以认为采集清晨第2次晨尿作为尿液标准来检测更加准确[9]。因此在多种尿检项目中都要求采集患者晨尿作为标本来检验。

综上所述，对HCMV感染患儿用荧光定量PCR法检测，不同时段尿液标本对检测结果会带来极大的影响，随机时段尿液标本由于有形成分含量低，因此检测结果准确性不高；而晨尿因其保留了被检测成分物质的含量及形态，所以阳性检出率更高，检测结果更准确，在小儿HCMV检测中应用效果较好，在临床中有推广应用的价值。

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（收稿日期：2017-11-07 本文编辑：崔建中）