芹菜素对小鼠肺损伤抗炎活性的体外评价

(酒泉职业技术学院,甘肃 酒泉 735000)

1 材料

1.1 实验菌株和细胞

RAW264.7 小鼠单核-巨噬细胞实验室自留。

1.2 主要试剂及药品

胰酶 美国 Hyclone公司

EDTA 美国 Sigma公司

二甲基亚砜(DMSO) 美国 Sigma公司

RPMI-1640 培养基 美国 Hyclone公司

脂多糖(LPS) 美国 Sigma公司

芹菜素标准品 中国药品生物制品检定所

1.3 主要仪器设备

细胞培养箱 SANYO 公司’细胞培养板 Costar公司

恒温干燥箱 上海恒一公司

二氧化碳恒温培养箱 三洋公司

高压蒸汽灭菌器 长春百奥生物公司

SW-CJ-IF 型超净工作台 北京东联哈尔仪器制造公司

高速低温台式离心机 德国 EFFENDOF公司

显微镜 奥林巴斯公司

低温高速冷冻离心机 德国 SORVALL公司

全自动酶标仪 奥地利 TECAN 公司

-80℃超低温冰箱 SANYO 公司

显微镜 奥林巴斯 公司

手术器械 伯乐 公司

半干转膜仪 美国伯乐 公司

湿转转膜仪 BIO-RAD 公司

TH2-82 型恒温振荡器 上海跃进医疗器械厂

1.4 所需试剂的配制

(1) PBS缓冲液(ph 7.2)的配置

NaCl 8.0 g

Na2HPO4·12H2O 3.63 g

KCL 0.2 g

KH2P040.24 g

去离子水 800 mL

后调节pH值为7.2 定容至1.0 L

(2) SDS-PAGE 电泳10%分离胶

去离子水 1.9 mL

30%丙烯酰胺 1.7 mL

1.5M Tris-HCl(pH=8.8) 1.3 mL

10%SDS 50 μL

10%过硫酸铵 50 μL

TEMED 2 μL

(3) SDS-PAGE 电泳5%浓缩胶

去离子水 2.1 mL

30%丙烯酰胺 0.5 mL

1.0M Tris-HCl(pH=6.8) 380 μL

10%SDS 30 μL

10%过硫酸铵 30 μL

TEMED 3 μL

(4) pH=6.8 Tris-HCL(1M)的配置

Tris-Base 12.11 g

去离子水 80 mL

调节pH值至6.8去水定容至100 mL

(5)pH=88 Tris-HCL(1.5M)的配置

Tris-Base 18.17 g

去离子水 80 mL

调节pH值至8.8去离子水定容至100 mL

(6) 10%过硫酸胺

过硫酸铵 1 g

去离子水 10 mL

(7) Tris-甘氨酸电泳缓冲液

Tris 3.02 g

甘氨酸 18.8 g

SDS 1.0 g

去离子水定容至1.0 L

(8) Western blot 转膜缓冲液的配置

Tris-Base 5.82 g

甘氨酸 2.93 g

SDS 0.375 g

甲醇 200 mL

加入去离子水定容至1 L

(9) TBS缓冲液(0.05%Tween-20)的配置

Tris-Base 2.422 g

NaCl 8.775 g

Tween 20

0.5 mL

去离子水定容至1.0 L

调节pH值至7.4

(10) 3% BSA

BSA 3 g

TBST 100 mL

200 mL

2 方法

2.1 药物浓度筛选

2.1.1 配制细胞培养基 1640培养基中加入5%～10%的胎牛血清、1%谷氨酰胺和双抗。

2.1.2 细胞的培养 从液氮中取出细胞，迅速在37°C水浴锅中进行解冻，无菌操作将冻存管中的细胞倒入细胞培养瓶中，加入带有胎牛血清的细胞培养液进行培养。待细胞约长到80%时对细胞进行传代培养。细胞消化需用胰酶进行消化，分装入细胞培养瓶中进行培养为后续的实验进行准备。

2.2 MTT 法测定细胞毒性

对数生长期RAW264.7细胞4×105个/mL接种于96孔培养板，芹菜素浓度0～40 μM预处理细胞1 h，设置调零孔，空白对照孔，每组重复四个。培养24 h后，每孔滴价20 μL MTT，放置温箱继续培养4 h后，弃掉培养液，每孔滴加150 μL DMSO，并放置于振荡器上震荡，最后用酶标仪570 nm波长检测。

2.3 qRT-PCR检测细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6

2.3.1 实验分组 空白对照组、LPS刺激组、芹菜素药物组(10、20、40 μM)组，每组设有三个重复。

2.3.2 接种 RAW264.7细胞接种于6孔板中，芹菜素预处理1 h后，LPS (1 μg/mL)刺激细胞4 h，弃去培养上清，PBS洗涤2次，利用Trizol法提取RNA。

表1 反转录体系

2.3.3 反转录 取适量RNA反转录，反转录体系如表1。

2.3.4 应用primer premier 5.0软件设计细胞因子的引物序列 如表1和表2所示。根据PCR试剂盒的说明书，按照表3所示的反应体系检测细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6基因的表达情况。

表2 细胞因子的引物序列

表3 qRT-PCR反应体系

2.4 免疫蛋白印迹

2.4.1 实验分组 空白组、LPS组、芹菜素组(10、20、40μM)组，每组设五个重复。

2.4.2 接种 4×105个/mL 的RAW264.7 细胞接于 6 孔细胞板中，每孔约有2 mL，37°C培养箱中培养24 h后，加入不同浓度芹菜素药物进行预处理1 h，LPS刺激细胞1 h，弃上清，用PBS进行清洗2到3次，加入蛋白裂解液200 μL进行裂解，用细胞刷收集细胞，5 min，12 000 p离心8 min，弃沉淀留上清，用BCA法测定蛋白浓度，最后加入相应的Loading Buffer和PBS于100℃煮沸10 min，分装并储存于-80℃冰箱。

2.4.3 配胶 清洗玻璃板，并固定于电泳架上，按配方配制5 mL 10%分离胶，摇匀后迅速灌入两块玻璃板之间，轻轻加入1 mL蒸馏水压平胶面，待胶凝固后，倒掉蒸馏水，配制5%的浓缩胶，迅速插入梳子，待其凝固。

2.4.4 上样 将电泳缓冲液加入电泳槽内，小心缓慢拔出梳子，然后将适量的蛋白样品缓慢加入到梳孔内，注意不要产生气泡，安装好电泳装置，接通电源。

2.4.5 跑胶 浓缩胶，恒压80 V，20 min；分离胶，恒压120 V，80 min，条带为一狭窄条带。

2.4.6 转膜 提前将剪好的滤纸放入转膜缓冲液内，剪下适应大小的PVDF膜放入甲醇内活化后，放入转膜缓冲液中。胶、PVDF膜与滤纸大小一致，按如下顺序：滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸依次放在转膜仪上，注意每层不可留有气泡，接通电源，进行转膜。

2.4.7 封闭 转膜结束，将PVDF膜放入5%脱脂乳或3%BSA中进行封闭，室温摇床封闭2～3 h。

2.4.8 一抗孵育 用TBST稀释一抗，使用cell signaling抗体按1∶1 000比例稀释，取出PVDF膜放入稀释好的一抗溶液中，4℃孵育过夜。

2.4.9 洗膜 TBST溶液洗膜三次，每次5 min。

2.4.10 二抗孵育 按1∶50 000比例TBST稀释二抗，取出PVDF膜放入稀释好的二抗溶液中，室温孵育2 h。

2.4.11 洗膜 TBST溶液洗膜三次，每次5 min。

2.4.12 显影 配制ECL工作液：在避光的容器中按A液:B液=1∶1的比例配制，在PVDF膜上滴加适量的ECL工作液，显影适当时间拍照，保存。

2.5 数据处理及统计

将以上实验结果进行方差分析，其结果用Means±SEM形式表示。数据差异性均采用方差分析和Student′s检验进行分析。P<0.05 和P<0.01 分别代表差异显著和差异极显著。

3 结果

3.1 芹菜素对 RAW264.7 细胞的活性影响

MTT 法检测不同浓度的芹菜素对细胞活性的影响，如图1所示，与空白对照组相比，芹菜素在0-40 μM范围对细胞活性影响较小，表明以上三个药物浓度对RAW264.7细胞没有毒性反应。

图1 MTT法检测芹菜素对RAW264.7细胞的毒性作用

3.2 芹菜素对LPS诱导的细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的影响

ELISA方法和qRT-PCR方法检测芹菜素对LPS诱导炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1?水平的影响。结果显示LPS刺激组的三种细胞因子与空白对照组相比显著上升，而芹菜素在10～40 μM范围内能够剂量依赖性地降低三种细胞因子的产生。

3.3 芹菜素对LPS刺激的RAW264.7细胞NF-κB信号转导通路的影响

LPS刺激细胞后，western blot结果显示(图3)，磷酸化的IκB、p65水平呈明显上升趋势。芹菜素在10～40 μM范围内能够剂量依赖性地降低IκB 、p65的磷酸化水平。

图2 实时荧光定量检测细胞因子基因水平表达情况

图3 Western Blot 检测RAW264.7细胞NF-kB信号通路激活情况

3.4 芹菜素对LPS刺激的RAW264.7细胞MAPKs信号转导通路的影响

如图所示，细胞被LPS刺激后，磷酸化ERK1/2、p38和JNK的水平呈现出显著上升。相比之下，芹菜素在10～40 μM范围内能够剂量依赖性地降低JNK、ERK1/2 和p38 的磷酸化水平。结果可以说明芹菜素对MAPKs 信号通路的激活起到了抑制的作用。

4 讨论

炎症是组织器官对损伤因子所产生的一种防御性反应。主要表现为红、肿、热、痛等机能障碍。革兰氏阴性菌的细胞壁的成分当中主要是LPS，LPS是引起炎症反应的炎症的主要成分。主要表现为，刺激动物机体产生炎性细胞因子。炎性细胞因子对机体会产生严重的病理学反应。前人已有研究，LPS刺激炎性细胞因子产生 TNF-α、IL-1β 和 IL-6等，细胞因子之间有相互协同作用。这些炎性细胞因子会引起强烈的炎症反应，会对机体产生极大的损害。炎症反应中最早出现的是TNF-α，可促使IL-1分泌， IL-1对机体的损伤和感染产生应答并刺激其他炎性因子的产生，对炎症发生过程起着重要的作用，IL-6在急性期炎症发生过程中起到重要作用。

图4 Western Blot 检测RAW264.7细胞MAPK信号通路激活情况

研究发现，LPS可以被TLR4信号通路识别，并激活下游的NF-κB 和 MAPKs信号通路来调控炎症细胞因子基因水平的表达。p65与IκB以二聚体、无活性的形式存在于细胞质内，在受到LPS刺激时，其二聚体发生解离，p65分子从细胞质转移至细胞核内，启动炎性细胞因子基因的转录，如TNF-α、IL-1β 和 IL-6。炎性细胞因子的产生与MAPKs信号通路也具有密切的关系，LPS刺激后，能够导致MAPKs信号通路中的ERK1/2，JNK 和 p38 的磷酸化水平上升。本实验通过检测芹菜素对 LPS 激活的 NF-κB 和 MAPKs表达来寻找其抗炎的机理。从实验的数据中可以发现，芹菜素确实抑制了NF-κB 和 MAPKs 的激活。通过实验结果我们可以的出下面的结论，芹菜素的抗炎作用很大程度上是因为抑制了NF-κB 和 MAPKs 的激活，所以抑制了炎症反应的出现。

5 结论

芹菜素对RAM.264.7细胞没有毒害作用。芹菜素在10～40 μM范围内能够剂量依赖性地降低TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子的产生。芹菜素能明显抑制RAM.264.7细胞中NF-κB和MAPKs信号通路的激活。

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