固相萃取-超高效液相色谱质谱法测定液体乳中爱德万甜

公丕学，杨昊，廉贞霞，薛霞，刘桂亮，王骏，刘艳明*

(1.山东省食品药品检验研究院，济南 250101；2.山东省药学科学院，济南 250101)

爱德万甜(Advantame)，分子式为N-(N-(3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙基-L-a-天冬氨酰)-L-苯丙氨酸-1-甲酯)(C24H30N2O7·H2O)，分子量为476.52，是阿斯巴甜的衍生产品，其化学结构与纽甜类似，见图1，是一种非营养、低热量、高强度的新型甜味剂，用量可以远低于现有市场上的蔗糖和其他甜味剂，能添加于多种食品中，甜味可达蔗糖的20000倍。2014年5月21日，美国FDA发布最终法规，修订食品添加剂条例，批准高倍甜味剂Advantame作为非营养甜味剂和增味剂用于除肉类及家禽之外的食品中[1]。日本厚生劳动省、FSANZ、美国FDA等允许爱德万甜作为甜味剂使用，根据FAO/WMO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)的评估结果，爱德万甜每日最大允许摄入量不超过5 mg/kg·bw[2,3]。

图1 爱德万甜分子结构图Fig.1 Molecular structure of advantame

目前，在国外爱德万甜作为一种新型超级甜味剂被广泛应用于食品、饮料和药品中,其安全性得到了国外食品安全机构的认可。国家卫计委在2017年10月31日发布《关于爱德万甜等6种食品添加剂新品种、环己基氨基磺酸钠(又名甜蜜素)等6种食品添加剂扩大用量和使用范围的公告(2017年第8号)》[4]，该物质可作为甜味剂用于多种食品类别，改善食品口感。国内仅有检测饮料中爱德万甜的液相色谱方法报道[5]，分离时间为15 min，线性范围为0.05～5.0 mg/L。在测定复杂基质时，液相色谱法存在干扰，降低方法的灵敏度，影响定量结果的准确性。国内还没有爱德万甜的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测方法，超高效液相色谱(UPLC)比高效液相色谱(HPLC)分析速度更快，分离能力更好，LC-MS/MS法将LC对复杂基质样品的分离优势，与串联质谱的高灵敏度、高选择性等优点结合起来，目前已经被广泛应用于食品分析检测[6-9]。液体乳基质复杂，在检测中能够显著影响目标离子生成效率及离子强度，从而影响检测结果的准确度和灵敏度。因此前处理过程中应除去干扰成分，常用的前处理方式有直接提取[10,11]、液液萃取[12]、SPE[13]、沉淀蛋白[14]、QuECHERS等方法[15-18]。

本研究结合SPE技术，采用UPLC串联MS技术检测液体乳中的爱德万甜，10 min 内即可完成目标物的分析检测，线性范围宽，检出限低，对食品中爱德万甜的检测有更广阔的应用前景。去除食品中基质干扰，提高分析灵敏度，建立了检测液体乳中爱德万甜的UPLC电喷雾串联三重四级杆质谱联用的分析方法，填补了国内检测爱德万甜质谱定性定量法的空白，对国内爱德万甜的探索研究具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

热电TSQ Quantiva三重四级杆质谱仪配备ESI电离源，热电U-3000液相色谱仪 美国赛默飞世尔公司；BSA822-cw型电子天平 德国赛多利斯公司；AB204-S型电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；MS-3基本型旋涡混合器 德国艾卡公司；超声波清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司；高速冷冻离心机 德国西格玛公司；Milli-Q超纯水机 美国密理博公司；控温氮吹仪 美国Organomation公司；HLB SPE柱(3 mL/60 mg) 美国Waters公司。

色谱柱：Accucore C18(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，色谱纯乙腈，色谱纯甲醇：购于美国Thermo Fisher公司；色谱纯醋酸铵：购于德国Flukar公司；分析纯氨水，分析纯亚铁氰化钾，分析纯乙酸锌：购于国药集团化学试剂(北京)有限公司；爱德万甜标样(纯度≥97.0%)：购于美国Sigma-Aldrich公司；0.22 μm孔径有机滤膜：购于上海安谱实验科技股份有限公司。

爱德万甜标准储备液的配制: 准确称取爱德万甜标准品 10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，配成1.00 mg/mL 的储备液，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2 样品预处理

1.2.1 样品提取

称取2 g(精确到0.01 g)液体乳样品到50 mL离心管中，加10 mL水涡旋分散混匀，分别准确加入沉淀剂0.3 mL亚铁氰化钾溶液(质量浓度为106 g/L)、0.3 mL乙酸锌溶液(质量浓度为183 g/L)涡旋分散混合均匀，超声波清洗器中超声提取30 min后，用水定容至15 mL，在离心机中以8000 r/min高转速下离心5 min，过滤取清液待净化。

1.2.2 样品净化

用3 mL甲醇、3 mL水活化HLB SPE 柱，将提取清液以1滴/s的速度上样，5 mL 5%甲醇淋洗，抽干，用5 mL甲醇分2次洗脱，然后用甲醇直接定容至5 mL，定溶液经有机滤膜过滤后待上机检测。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件色谱柱

Accucore C18；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%甲酸，液相色谱流动相梯度洗脱程序见表1；流动相流速：0.30 mL/min；柱温箱温度：40 ℃；进样针进样体积：5 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase gradient elution program

1.3.2 质谱条件电离源离子化模式

电流方式ESI+；气体流速： 40 units；辅助气体流速：12 units；喷雾电压：3500 V；离子传输管温度：333 ℃；蒸发器温度：317 ℃；碰撞气体压力(Ar)：2mTorr。爱德万甜优化的关键质谱参数见表2。

表2 爱德万甜优化的关键质谱参数Table 2 The optimized MS parameters of advantame

注：*为定量离子。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

流动相的酸碱性影响爱德万甜离子化效率，同时会影响液相色谱峰峰形，本试验比较了中性流动相A(乙腈-水)、碱性流动相B(乙腈-0.1%氨水，V/V)、酸性流动相C(乙腈-0.1%甲酸，V/V)3种不同酸度流动相体系。在相同液相色谱分离程序下，考察爱德万甜色谱峰峰形以及响应情况，定量离子质谱图见图2。

图2 爱德万甜在不同酸度流动相的定量离子(459>192)质谱图Fig.2 Mass spectrograms(459>192) of advantame in different mobile phases

注：A为中性流动相；B为碱性流动相；C为酸性流动相。

实验结果表明：乙腈-0.1%甲酸流动相条件下的目标物峰形要优于另外两种流动相的峰形，质谱信号响应值增强。实验中采用正离子模式检测，使用酸性流动相能够提高爱德万甜离子化效率，响应信号强度增强，灵敏度提高。使用碱性流动相抑制爱德万甜离子化效率，信号强度降低了1/2，中性流动相中信号强度降低，峰形差，影响定性定量结果。因此，选取乙腈-0.1%甲酸作为流动相，色谱峰峰形好，灵敏度高。

2.2 质谱条件的优化

液相色谱串联质谱中常用的电离方式有ESI和APCI，根据分子结构可以看出爱德万甜属于极性较强的化合物，APCI优势在于检测中等或者小极性的化合物，因此试验中选择ESI电离分析方式。

爱德万甜分子结构中含有2个仲氨基团，容易结合氢，形成[M+H]+准分子离子峰，因此在质谱检测中离子源电离模式选择时，应该首先考虑使用ESI+模式。爱德万甜分子量为476.52，去掉H2O后的分子量为458.504，根据形成[M+H]+准分子离子峰推算出母离子为459.504 m/z。将质量浓度为100 ng/mL的爱德万甜标准溶液通过蠕动泵直接注入三重四级杆质谱仪，在ESI+模式下进行爱德万甜母离子扫描，确定其准分子离子峰丰度最大条件，得到爱德万甜的母离子为459 m/z；调节质谱关键参数后进行爱德万甜的子离子扫描，然后进一步优化碰撞电压等质谱参数，选择2个丰度较高的子离子，以丰度相对高的子离子459>192作为定量离子，以丰度相对较低的子离子459>102作为辅助定性离子。爱德万甜标准溶液的MRM见图3。

图3 爱德万甜标准溶液的MRM色谱图Fig.3 MRM chromatograms of advantame standard solution

注：A为定量离子459>192；B为定性离子459>102。

2.3 沉淀剂使用量的影响

液体乳中含有蛋白质、脂肪、磷脂等，在分析检测过程中，基质成分与待测物在雾滴表面离子化竞争过程中能够显著增强或降低目标离子生成效率及离子强度，从而对检测结果会产生严重影响，因此在前处理过程中需加入沉淀剂去除杂质组分的干扰。沉淀剂的使用量影响沉淀效果和过滤时间,因此考察了沉淀剂的加入体积为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL时与过滤时间的对应关系，见图4中A。不加入沉淀剂时，过滤时间较长，当沉淀剂用量大于0.3 mL时，过滤时间小于12 min并趋于稳定。考察了沉淀剂加入体积为0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0 mL对峰面积响应值的影响，见图4中B。

图4 沉淀剂使用量的影响Fig.4 The influence of precipitant

注：A为沉淀剂使用量与过滤时间的关系；B为沉淀剂使用量与峰面积的关系。

当沉淀剂大于0.3 mL时峰面积响应值逐渐降低，灵敏度降低，综合考虑，选择沉淀剂体积为0.3 mL时，既可以提高工作效率，又可以保证检测灵敏度。

2.4 SPE柱的选择

SPE柱的使用能够进一步提高杂质去除效果和灵敏度。在实验中考察了C18柱、WAX柱、HLB柱、 SAX柱和 MAX柱5种SPE柱对液体乳中爱德万甜的净化效果，见图5。

图5 爱德万甜通过不同SPE柱的回收率Fig.5 The recoveries of advantame through different SPE columns

由图5可知，使用HLB SPE柱时回收率最高，因此实验中选用HLB SPE柱净化样品，提高检测的灵敏度和准确度。

2.5 方法的线性范围和检出限

将基质加标标准工作溶液按浓度从低到高依次经超高效液相色谱-串联质谱法测定，以爱德万甜标准工作溶液的质量浓度(ng/mL)为横坐标，以其丰度较高的定量离子对响应峰面积为纵坐标，绘制爱德万甜标准工作曲线，在1～1000 ng/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=8001x-9.554，线性相关系数为0.9992。以信号与噪音比值S/N≥3作为检出限(LOD)计算结果为2 μg/kg。空白样品色谱图见图6，样品加标色谱图见图7。

图6 空白样品质量色谱图Fig.6 MRM chromatograms of blank samples

注：A为定量离子459>192；B为定性离子459>102。

图7 加标样品质量色谱图Fig.7 MRM chromatograms of spiked samples

注：A为定量离子459>192；B为定性离子459>102。

2.6 方法的回收率和精密度

采用不同类型液体乳(灭菌乳、调制乳和发酵乳)空白样品，进行添加回收率和精密度的实验。空白样品中分别添加50，100，500 μg/kg 3个浓度水平，按照本方法进行处理，每个添加水平进行平行测定6次。同时使用基质匹配标准溶液进行回收率和偏差计算，结果见表3。

表3 添加回收率与精密度(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs for the determination of advantame(n=6)

由表3可知，爱德万甜的回收率在90%～116%。不同水平加标样品重复测定6次，测定结果表明RSD为0.21%～1.59%。结果表明该方法能够满足实际样品的检测需要。

3 结论

通过优化实验条件，选择沉淀剂(亚铁氰化钾和乙酸锌)分别为0.3 mL，HLB SPE柱，能够提高方法的准确性及灵敏度，选择能够增强离子化效率的酸性流动相(乙腈-0.1%甲酸)，建立了SPE-超高效液相色谱电喷雾串联三重四级杆质谱联用检测液体乳中爱德万甜的分析方法。

本方法具有线性范围宽、检出限低、效率高、灵敏度高、定性、定量准确等优点，适用于不同类型液体乳中爱德万甜的定性确证与定量检测，填补了国内超高效液相色谱串联质谱法测定爱德万甜的空白，可以为政府监管提供技术支持，为制定食品安全标准提供理论依据。

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