超声波辅助盐溶法提取杏鲍菇蛋白的工艺优化

郎田田，雷姝敏，陈红

(扬州大学 旅游烹饪学院 食品科学与工程系，江苏 扬州 225127)

杏鲍菇(Pleurotuseryngii) 的品质非常优良,具有良好的风味、口感，并且含有丰富的营养物质[1]。杏鲍菇的营养功能性物质含量丰富、脂肪含量较少，具有较高的研究价值，近年来对杏鲍菇功能性物质的提取、开发以及利用愈发火热[2,3]。碱溶酸沉法是提取杏鲍菇蛋白较为常用的方法，虽然此方法蛋白提取率高，但提取的蛋白质会因为提取液是强碱而发生变性，蛋白的生物活性以及其利用价值会被影响[4]。

本试验是在上述背景的前提下进行研究的,以杏鲍菇为原料,稀NaCl溶液为提取液,超声波辅助提取杏鲍菇粗蛋白,以期获得最佳的提取条件,可以提高杏鲍菇及杏鲍菇内的功能性物质的开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杏鲍菇：购于江苏省徐州市丰县；考马斯亮蓝、牛血清蛋白(BSA)、维生素C、NaCl：以上均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SP-756P 紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;FD-A10N-50冷冻干燥机 上海皓庄仪器有限公司;SKD-100 凯式定氮仪 上海沛欧有限公司;电脑智能温控低温超声波合成萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司;J25立式低温离心机 美国贝克曼库尔特公司。

1.3 方法

1.3.1 新鲜杏鲍菇的预处理方法

将杏鲍菇子实体用自来水清洗，室温下晾干后切成体积为1 cm3的小块，用液氮速冻后装入保鲜袋中，保存于-80 ℃超低温冰箱。将速冻后的杏鲍菇材料冷冻干燥，经粉碎后过80目筛，保存于有硅胶的干燥皿中备用。

1.3.2 杏鲍菇蛋白提取的单因素试验[5,6]

1.3.2.1 NaCl溶液的浓度对蛋白提取率的影响

在杏鲍菇干粉和NaCl溶液的料液比为1∶40、温度为40 ℃、超声波功率为400 W的条件下,分别调整NaCl溶液的浓度为1%，2%，3%，4%，5%,反应30 min后,测定蛋白质提取率,确定最适初始NaCl溶液的浓度。

1.3.2.2 提取时间对蛋白提取率的影响

在杏鲍菇干粉和NaCl溶液的料液比为1∶40、NaCl溶液的浓度为1%、超声波辅助温度为40 ℃、功率为400 W的条件下,反应时间设定为10～50 min,每档间隔10 min，反应结束后,测定蛋白质提取率,确定最适初始反应时间。

1.3.2.3 料液比对蛋白提取率的影响

在NaCl溶液的浓度为1%、超声波辅助温度为40 ℃、功率为400 W的条件下,设定杏鲍菇干粉和NaCl溶液的比例为1∶60，1∶50，1∶40，1∶30，1∶20,反应30 min后,测定蛋白质提取率,确定初始反应的料液比。

1.3.2.4 提取温度对蛋白提取率的影响

在杏鲍菇干粉和NaCl溶液的料液比为1∶40、NaCl溶液的浓度为1%、超声波辅助功率为400 W的条件下,设定温度为20～60 ℃,每档间隔10 ℃，反应30 min后,测定蛋白质提取率,确定最适初始温度。

1.3.2.5 超声波功率对蛋白提取率的影响

在杏鲍菇干粉和NaCl溶液的料液比为1∶40、NaCl溶液的浓度为1%、超声波辅助温度40 ℃的条件下,设置超声波功率为200～600 W,每档间隔100 W，反应30 min后,测定蛋白质提取率,确定最适初始超声功率。

1.3.3 杏鲍菇蛋白质提取率的测定

使用考马斯亮蓝法来对蛋白含量进行测定，参照Bradford的方法，并做相应修改[7]。

杏鲍菇蛋白质提取率=提取液蛋白浓度×提取液体积原料质量×原料总蛋白质量分数×100%。

1.3.4 响应曲面优化法[8]

1.3.4.1 响应面试验设计

单因素试验结果表明，料液比、提取温度和提取功率是影响蛋白提取率最显著的因素，根据Box-Behnken中心组合原理设计了响应面分析试验，具体因素、水平见表1。

表1 超声波提取杏鲍菇蛋白响应面分析因素和水平表Table 1 The factors and levels of response surface analysis of ultrasonic extraction for Pleurotus eryngii

1.3.4.2 响应面试验回归模型的建立

使用Design Expert 7.0.0软件对试验结果进行多元回归分析,得到杏鲍菇蛋白提取率与料液比A、提取温度B、提取功率C的真实值的二次回归模型。

1.3.4.3 响应曲面分析

在简化的回归模型上，做料液比与温度、料液比与功率、温度和功率两两因素对杏鲍菇蛋白提取率影响显著性的响应曲面和等高线图，另一个因素在零水平。

2 结果与讨论

2.1 单因素优化试验

2.1.1 NaCl浓度对蛋白质提取率的影响

蛋白提取率随着NaCl浓度变化的结果,见图1。

图1 NaCl浓度对蛋白质提取率的影响Fig.1 The effect of NaCl concentration on the extraction rate of protein

NaCl浓度在0～2%范围时,蛋白提取率随着NaCl浓度的增加而增加,可能是由于离子浓度升高,导致蛋白表面电荷数增加,蛋白质的溶解度也随之增加;而NaCl浓度大于 2%时,蛋白提取率却有所降低,这可能是因为蛋白表面的电荷数已经达到饱和,高浓度NaCl的电离反而会打破蛋白分子和水分子之间的相互作用,降低蛋白的溶解性。因此,选择 2%为初始最佳NaCl浓度。

2.1.2 提取时间对蛋白质提取率的影响

蛋白提取率随着反应时间变化的结果,见图2。

图2 反应时间对蛋白质提取率的影响Fig.2 The effect of reaction time on the extraction rate of protein

当反应时间范围在10～20 min时,蛋白质的提取率随着时间的变长而得以提高,这可能是因为超声波会使细胞产生强烈的振动,细胞壁被破坏,细胞内的蛋白质进入溶液,20 min恰好是细胞壁破坏的饱和时间;当反应时间达到30 min时,蛋白质的提取率达到平衡,时间过长反而会使提取率下降。因此,挑选20 min为初始超声时间。

2.1.3 料液比对蛋白质提取率的影响

蛋白提取率随着料液比变化的结果，见图3。

图3 料液比对蛋白质提取率的影响Fig.3 The effect of ratio of material to liquid on the extraction rate of protein

在料液比在1∶20～1∶30范围时,蛋白溶解率随着料液比的降低而升高,可能原因是在较高料液比时,提取液粘度过高阻碍了蛋白的溶解,当料液比下降时,提取液粘度和分子间作用力都有所下降,蛋白的溶解率提高;当料液比低于1∶30 时,对溶液进行稀释已经不能提高蛋白的溶解率,达到稳定的平衡状态。因而,选取1∶30 为初始最佳提取料液比。

2.1.4 温度对蛋白质提取率的影响

蛋白质提取率随着温度变化的结果，见图4。

图4 温度对蛋白质提取率的影响Fig.4 The effect of temperature on the extraction rate of protein

提取温度在20～50 ℃时,蛋白溶解率会随着温度提高而明显变高,当提取温度高于50 ℃时,提取率反倒会有所降低。这种现象是因为温度升高能够增加蛋白质在溶液中的溶解度,而温度再次提高时,蛋白质的疏水基团会产生反应,从而影响蛋白质的提取率。因而，挑选50 ℃为初始提取温度。

2.1.5 超声波功率对蛋白质提取率的影响

蛋白质提取率随着功率的变化结果，见图5。

图5 超声波功率对蛋白质提取率的影响Fig.5 The effect of ultrasonic power on the extraction rate of protein

杏鲍菇蛋白质提取率在功率为400 W时最高,当超声波功率提高时,溶解率先变高后不变。这是可能是因为功率的增加加强了细胞的振动反应,细胞壁更容易被破坏,胞内蛋白也更多的进入提取液;当功率高于400 W时,细胞振动反应已经饱和,不会提高蛋白溶解,反而可能会破坏已经溶出的蛋白结构。因此,选取400 W为后续试验功率。

2.2 响应面分析法优化试验的结果

2.2.1 响应面试验的结果

超声波提取杏鲍菇蛋白响应面分析试验的结果见表2。

表2 超声波提取杏鲍菇蛋白响应面分析试验的结果Table 2 Pleurotus eryngii response surface analysis results with ultrasonic extraction

续 表

2.2.2 响应面试验回归模型的建立

利用Design Expert 7.0.0软件对响应面试验结果进行多元回归分析，得到杏鲍菇蛋白提取率与料液比A、提取温度B、提取功率C的真实值的二次回归模型为Y=53.37+4.85A+2.53B-1.09C+5.92AB-0.78AC-1.38BC-13.83A2-5.70B2-2.22C2。

回归模型的方差分析结果,见表3。

表3 回归方程模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation model

注：决定系数R2=0.9969,调整决定系数adj-R2=0.9930;*为差异显著(P<0.05)；**为差异极显著(P<0.01)。

模型P<0.0001,表明具有极显著性差异,说明不同提取条件下,杏鲍菇蛋白的提取率有显著性差异;在本试验所选因素水平内，对提取率的影响次序为A>B>C,即料液比>提取温度>超声功率;A，B对模型具有极显著性影响(P<0.01),C因素有显著影响。各因素的交互项AB影响极显著,表明提取温度和料液比对杏鲍菇蛋白提取有极显著性影响,AC对模型有显著性影响，BC对模型影响不显著;二次项A2，B2，C2对模型具有极显著的影响。

2.2.3 响应曲面分析

各个因素交互的响应曲面和等高线图见图6～图8。

图6 料液比与温度两因素及其交互作用响应面图和等高线图Fig.6 The response surface and contour plot ofratio of material to liquid and temperature and the interaction

图7 料液比与功率两因素及其交互作用响应面图和等高线图Fig.7 The response surface and contour plot of ratio of material to liquid and power and the interaction

图8 温度和功率两因素及其交互作用响应面图和等高线图Fig.8 The response surface and contour plot of temperature and power and the interaction

由图6可知，沿温度和料液比方向的等高线密集程度、曲面陡峭程度相当,均较密集或陡峭,阐明这两种因素对提取率产生的影响相当,且均为显著性影响。在提取温度57 ℃、料液比1∶38 (g/mL)有峰值,杏鲍菇蛋白提取率最高。由图7可知,沿料液比方向比沿功率方向等高线密集,曲面陡峭,说明料液比能够对杏鲍菇蛋白的提取率产生显著的影响。在提取料液比1∶38 (g/mL)、功率337 W时有峰值,杏鲍菇蛋白提取率最高。由图8可知,沿功率方向比沿温度方向等高线稀疏,表明温度对杏鲍菇蛋白提取率产生显著的影响。在提取温度 57 ℃、功率337 W时有峰值,杏鲍菇蛋白提取率最高。

2.2.4 杏鲍菇蛋白提取工艺

在NaCl浓度2%、提取时间20 min、提取温度57 ℃、料液比1∶38、超声波功率340 W条件下提取率最高。过3次重复验证试验，蛋白质平均提取率为57.9%，工艺稳定。

3 结论与展望

3.1 结论

本试验以杏鲍菇为原料,超声波辅助盐溶法提取杏鲍菇粗蛋白。通过实验得出以下结论：在NaCl浓度2%、提取时间20 min、提取温度57 ℃、料液比1∶38、超声波功率340 W条件下提取率最高，为57.9%。

3.2 展望

杏鲍菇的子实体提取物已被证实具有许多重要的生物活性,例如抗氧化活性、抗菌活性和免疫调节活性等[9,10]。通过本次研究,获得了超声波辅助盐析法提取杏鲍菇蛋白的最佳条件,这种提取工艺条件较为温和,不会对蛋白质结构和功能有较大的破坏,为今后杏鲍菇蛋白生物活性的研究提供了更多的可能,可以提高杏鲍菇及杏鲍菇内的功能性物质的开发利用[11]。

参考文献：

[1]王凤芳.杏鲍菇中营养成分的分析测定[J].食品科学,2002,23(4):132-135.

[2]Mariga A M,Pei F,Yang W J,et al.Immunopotentiation ofPleurotuseryngii(DC.ex Fr.) Quel[J].Journal of Ethnopharmacology,2014,153(3):604-614.

[3]张梦甜,杨文建,裴斐,等.响应面法优化酶法制备杏鲍菇蛋白及其营养评价[J].食品科学,2015,36(13):125-130.

[4]刘庆,李超,耿中华,等.碱提酸沉法制备杏鲍菇蛋白质的工艺优化[J].食品工业,2013(10):145-148.

[5]漆倩涯,贠建民,黄玉琴,等.超声破碎辅助蜗牛酶提取杏鲍菇蛋白工艺优化[J].食品科学,2016,37(22):85-91.

[6]李大文.苦杏仁蛋白提取工艺研究[D].咸阳：西北农林科技大学,2013.

[7]张志涛,刘金生,许强,等.Bradford法测定牛奶中蛋白质含量[J].食品与机械,2011,27(5):128-130.

[8]李超.超声辅助提取迷迭香挥发油的工艺优化[J].中国调味品,2015，40(6):62-64.

[9]Alfred Mugambi Mariga.杏鲍菇蛋白抗氧化活性、抗增殖活性及免疫调节活性研究[D].南京：南京农业大学,2014.

[10]Sun Y,Hu X,Li W.Antioxidant,antitumor and immunostimulatory activities of the polypeptide fromPleurotuseryngiimycelium[J].International Journal of Biological Macromolecules,2017,97:323.

[11]唐茂芝,贝峰.食用菌类食品作为功能性食品的优势和特点[J].食品科技,1999(3):5-6.