小麦 TaPLC1基因与耐热的相关性研究

姚晓露，杨明明，高 翔，2，董 剑，赵万春，张炳慧，王卫东，何庆梦

(1.西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100； 2.陕西省小麦新品种培育工程研究中心，陕西杨凌 712100)

小麦(TriticumaestivumL.)属于喜凉作物，在生长季内热胁迫会对产量造成影响[1]。据调查，未来平均气温每升高1 ℃，全球小麦将减产6%，而且温度的升高会对小麦的一些生理指标产生影响[2]。作为仅次于水稻的第二大粮食作物，小麦减产会增加粮食安全的风险[3]。作为磷脂酶家族重要的成员，磷酸肌醇特异性磷脂酶C(phosphoinositide-specific PLC，简称PI-PLC)在植物生长发育过程中起到重要作用，参与多种环境胁迫应答[4]。PI-PLC的结构虽然简单，但在植物中的功能却复杂多样。在玉米中， ZmPLC1通过促进细胞的不对称分裂对植株的发育进行调控[5]。在油菜中，过表达 BnPLC2基因可以加速植株生长、提高粒重及油含量[6]。Djafi等[7]发现PI-PLC抑制剂能够抑制植酸的合成，而植酸通路在籽粒发育中非常重要，涉及营养物质的运输。Zhang等[4]对小麦幼苗研究发现，外源施加PI-PLC的抑制剂U73122和Edelfosinec能够抑制幼苗生长，并且增强了幼苗对干旱和盐胁迫的敏感性。Aggarwal等[8-9]发现用脱落酸(ABA)处理小麦籽粒后， TaPLC1基因以及部分植酸通路基因的表达量显著增加，由此可知，激素可能参与PI-PLC对植物生长发育过程中的调控作用。

PI-PLC水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸生成两个重要的信号分子肌醇三磷酸(IP3)和甘油二醇(DAG)，进而参与植物的生长发育[10]。PI-PLC一直被认为是胁迫诱导激活的酶[11]，U73122被认为是专一的PI-PLC抑制剂，广泛地用于植物PI-PLC的功能研究[12]。热胁迫时，U73122阻止IP3的积累，IP3影响了Ca2+释放，而Ca2+参与植物非生物胁迫[如盐胁迫、干旱胁迫(正)、冷胁迫(负)]的调控[10,13-15]。已有证据表明小麦中TaPLC基因参与非生物胁迫的应答反应[16]，影响小麦苗期的抗旱性、耐盐性和耐冷性[4,17]。在拟南芥中，PI-PLC参与热胁迫调节[18]。本研究选取热敏感型及耐热型小麦材料，并用U73122进行处理，分析小麦 TaPLC1基因与耐热的相关性，以期为解析小麦的耐热性机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为普通小麦品种中国春和TAM107，中国春为热敏感型品种，TAM107为耐热型品种，均由西北农林科技大学农学院品质改良实验室提供。

1.2 材料处理

选取成熟饱满大小均匀一致的中国春和TAM107种子，首先用75%的酒精消毒1 min，无菌水冲洗3次；随后用5% NaClO消毒10 min，无菌水冲洗4～5次，于灭菌水中浸泡24 h 后将种子移种到铺有3层滤纸的培养血上，每皿30粒种子，萌发前保持滤纸湿润，待幼苗的根能够固着在滤纸上后，使用霍格兰氏营养液进行培养，每3 d更换一次培养液。培养温度为 24 ℃/18 ℃(光照14 h/黑暗10 h)。

处理如下，(1)一叶一心时期，用15 μmol·L-1PI-PLC抑制剂U73122浸泡根部4 h，两叶一心期在40 ℃条件下进行热胁迫处理；(2)两叶一心期在40 ℃条件下进行热胁迫处理；(3)不进行抑制剂和热胁迫处理(CK)。各处理均设3个重复，分别在热胁迫0 min、15 min、30 min、1 h、2 h和4 h 取各处理的幼苗叶片，并迅速放入液氮中速冻，然后于-80 ℃ 冰箱保存。将热处理4 h的幼苗转入24 ℃/18 ℃(光照/黑暗)条件下继续培养，观察记录幼苗的生长情况。

1.3 生理指标的测定

热胁迫处理4 h的材料用于测定生理指标。叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，可溶性糖含量采用蒽酮法测定，叶绿素含量采用Arnon法测定，每个样品设置三个生物学重复[19-20]。用 Excel 2016 和 SPSS 20 软件进行数据分析。

1.4 TaPLC1基因的表达分析

1.4.1 RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法从中国春和TAM107正常生长及处理后幼苗的叶中提取RNA，使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA第一链，-20 ℃保存备用。

1.4.2 引物设计与qRT-PCR

根据 TaPLC1基因的cDNA序列，利用 Primer Premier 5.0设计实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)引物，正向引物为5′-GGGCACTCGGGTTACTTC-3′，反向引物为5′-GTAGCCACAGCCACCATT-3′。在18S RNA上设计的引物 T-18S-F/R作为内参，其正向和反向引物序列分别为5′-GCATTTGCCAAGGAT GTTTTC-3′和5′-TGCTATGTCTGGACCTG GTAAGT-3′。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

以cDNA为模板，用上述合成引物，在QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪上进行 qRT-PCR分析。qRT-PCR反应总体系20 μL：SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL，10 μmol·L-1引物各1 μL，cDNA模板 2 μL，灭菌ddH2O加至20 μL。扩增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40个循环。每个样品设置3个生物学重复。采用 2-ΔΔCT法[21]分析实验数据，确定基因的相对表达水平。

2 结果与分析

2.1 热胁迫和PI-PLC抑制剂对小麦苗期生理指标的影响

两个品种热胁迫4 h时的叶片生理指标测定结果如表1所示。相对于正常幼苗，热敏感型品种中国春和耐热型品种TAM107的叶片在热胁迫后MDA含量、SOD含量和可溶性糖含量不同程度增加，叶绿素含量下降。热胁迫下，以单独热胁迫幼苗为对照，抑制剂处理后中国春和耐热型品种TAM107叶片丙二醛含量、SOD含量和可溶性糖含量与对照相比均有不同程度的增加，叶绿素含量不同程度降低。从表1生理指标整体变化趋势可以看出，热胁迫下，抑制剂处理后中国春的生理指标相对于TAM107 变化更大。

这些生理指标的变化说明，抑制剂处理后两品种对热胁迫均更敏感，PI-PLC抑制剂影响幼苗的耐热性，对热敏感型品种影响更大。

2.2 热胁迫和PI-PLC抑制剂对小麦幼苗表型的影响

两叶一心期观察幼苗表型，进行热胁迫处理，并记录胁迫前后的变化，结果如图1所示。处理前幼苗长势一致、较好，热胁迫处理4 h时中国春发生萎蔫，TAM107轻微萎蔫，处理后12 h均恢复正常。一叶一心期进行过抑制剂处理的两个品种，在热胁迫处理4 h后的第2天，幼苗叶尖出现轻微枯萎变黄现象，处理后第5天严重枯萎，叶片开始卷曲。

2.3 热胁迫下 TaPLC1基因的表达特性分析

以获得的RNA为模板进行反转录，采用qRT-PCR引物进行荧光定量PCR，测定 TaPLC1基因在两个品种(中国春和TAM107)两叶一心期不同热胁迫处理时间的表达并分析品种之间的差异。由图2可知，以正常植株的叶片作对照，在热胁迫过程中，未经抑制剂处理的中国春叶片中 TaPLC1基因的表达量先上升，在30 min达到最大值，为起始值的3.3倍，之后开始下降；未经抑制剂处理的TAM107叶片中 TaPLC1基因的表达量先上升，在30 min达到最大值，数值为起始值的14.3倍，之后开始大幅度下降，在1 h达到最小值，数值为起始值的17%，之后开始上升，在2 h达到起始值的72%，之后再次下降。抑制剂处理后，中国春叶片中 TaPLC1基因的表达量在热胁迫过程中先下降，15 min之后开始上升，30 min达到最大值，为起始值的2.3倍，之后又下降，整体呈现下降-上升-下降-上升-下降的趋势；TAM107叶片中 TaPLC1基因的表达量先上升，在30 min达到最大值，为起始值的1.4倍，之后开始下降，2 h达到最小值，为起始值的61%，之后又上升。未经抑制剂处理、热胁迫条件下， TaPLC1基因在两个品种中的表达均迅速上调，并在30 min处达到最大值， TaPLC1基因在耐热型小麦品种TAM107中的表达上调幅度明显大于中国春。抑制剂处理后，热胁迫时 TaPLC1基因在两个品种中的表达模式不同，耐热型小麦品种TAM107中的上调幅度较小，响应热胁迫的程度不明显；中国春在热胁迫15 min内未及时响应，但之后迅速响应，在30 min处达到最大值，与未经抑制剂处理幼苗变化幅度差异不明显。

表1 PI-PLC抑制剂处理的幼苗在热胁迫4 h后的相关生理指标Table 1 Relevant parameters of seedlings treated with PI-PLC inhibitors under heat stress for 4 h

CK：未经热胁迫及抑制剂处理的幼苗；40 ℃：40 ℃热胁迫处理4 h；U73122：抑制剂U73122处理；同一列数据后的不同字母表示处理间在0.05水平上差异显著。

CK:Seedlings untreated with heat stress and inhibitors; 40 ℃:40 ℃ heat treatment for 4 h;U73122:U73122 inhibitor treatment;Different letters following data in same column indicates significant difference between treatments at 0.05 level.

A：热胁迫前；B：热胁迫4 h；C：热胁迫4 h后的第2天；D：热胁迫4 h后的第5天。

A:Before heat stress;B:Heat stress for 4 h;C:The second day after heat stress for 4 h;D:The 5th day after heat stress for 4 h.

图1PI-PLC抑制剂处理后小麦幼苗对热胁迫的反应

Fig.1ResponseofwheatseedlingstoheatstressaftertreatedwithPI-PLCinhibitors

对比抑制剂处理和未处理幼苗中的基因表达情况，发现U73122在一定程度上抑制了幼苗中 TaPLC1基因的表达(图2)，40 ℃热胁迫4 h后停止胁迫，未经抑制剂处理的幼苗均恢复正常，而 U73122处理的幼苗受到损伤(图1)，说明 TaPLC1基因表达被抑制后幼苗对热胁迫的敏感性增加，也说明 TaPLC1可能参与了小麦幼苗的耐热调控过程。

A:未经抑制剂处理的中国春;B:未经抑制剂处理的TAM107;C:经抑制剂处理的中国春;D:经抑制剂处理的TAM107；CK：未经热胁迫及抑制剂处理的幼苗。

A:Chinese Spring untreated with inhibitor; B:TAM107 untreated with inhibitor; C:Chinese Spring treated with inhibitor; D:TAM107 treated with inhibitor; CK:Seedlings untreated with heat stress and inhibitors.

图2TaPLC1在40℃热胁迫下的表达模式

Fig.2ExpressionpatternsofTaPLC1under40℃heatstress

3 讨 论

MDA是膜脂过氧化的重要产物之一，发生膜脂过氧化作用时[22]，会产生较高含量的MDA[23]。热胁迫时，热敏感基因型品种较耐热型品种MDA含量增加较多[24]。植物体内的内源保护系统由酶和非酶组成[25]，SOD是一种源于生命体的活性物质，植物通过自身调节机制提高SOD活性以适应热胁迫，若长时间遭受热胁迫，SOD活性下降，则会加剧膜脂过氧化作用，引起膜损伤[26]，耐热型小麦品种的SOD活性较高[27-30]。叶绿素是一类与光合作用有关的重要色素，热胁迫会加速叶绿素降解，含量下降，在黑麦和小麦中已经得到证实[31-33]。可溶性糖是渗透调节物质，胁迫条件下植物的渗透调节功能与可溶性糖的积累有关[34]，在逆境下可溶性糖含量升高有利于植物体对抵抗逆境胁迫，从而在一定程度上可增强生物体对环境胁迫的适应性[26]。本试验中抑制剂处理后两种类型小麦品种的叶片MDA含量均显著升高，说明抑制剂处理后的幼苗叶片发生了更严重的膜脂过氧化作用，而SOD的活性也均显著升高，说明抑制剂处理后幼苗需要更高的SOD活性来应对热胁迫；叶绿素含量均显著下降，在5 d后叶片变黄不再恢复，并且抑制剂处理使小麦需要更多的可溶性糖来抵抗高温，说明抑制剂处理后小麦的耐热性下降。以上结果与前人的研究一致。而抑制剂处理后中国春MDA含量、SOD活性以及可溶性糖含量变化幅度均大于TAM107，叶绿素含量则相差不多，说明PI-PLC可能参与了小麦热胁迫应答反应，并且中国春较TAM107更加敏感。

研究表明，PI-PLC是通过水解产生IP3和DAG来参与植物生长发育的，热激使成纤维细胞PI-PLC降解生成IP3[35]，IP3快速上升，而IP3伴随着Ca2+的增加而增加[36]。热激诱导人类表皮癌细胞A-431中IP3的水平增加，但U73122阻止热激引起的IP3增加[37]。本研究表明，小麦受到热胁迫时 TaPLC1迅速增加以应对热胁迫，同时U73122处理过的幼苗 TaPLC1增加幅度变小。TAM107中该基因表达增加的幅度明显变小，可能与其较强的耐热性有关；而中国春中该基因表达增加的幅度变小不明显，可能与其热敏感性有关。抑制剂处理后幼苗的表型，受损比较严重，进一步说明了 TaPLC1基因在热胁迫应答中的重要作用。TAM107的耐热性较强极有可能与 TaPLC1的高表达有关， TaPLC1基因参与小麦耐热性的具体机制有待于进一步研究。

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