松贝和青贝的镇咳、平喘、化痰和抗炎作用比较研究Δ

李亚玲，张继，陈洪燕，李玲，张世波（.西南医科大学附属医院药学部，四川泸州646000；.中国食品药品检定研究院中药标本馆，北京 00050；.新疆医科大学附属中医医院药学部，乌鲁木齐 80000；4.泸州市中医院药剂科，四川泸州 646000）

川贝（Fritillariae cirrhosaeBulbus）是川产道地常用名贵中药，具有“止咳圣药”之称[1]，其用药历史悠久、疗效显著、开发价值高且市场需求大。由于用药历史、产地、商品交易等原因，川贝的商品规格等级复杂繁多，2015年版《中国药典》（一部）按性状不同将川贝分为松贝、青贝、炉贝和栽培品4个商品规格，其中松贝具有“怀中抱月”“观音坐莲”“蒜泥蒂”等性状鉴别特征，青贝具有“观音合掌”“开口笑”等性状鉴别特征[2]。药材的商品规格等级被认为是药材品质的外在表现[3]，市场价格也是按药材的商品规格等级而定。传统一直认为川贝个体越小质越优，且以松贝质量为佳，青贝次之，导致历年来中药材交易市场上同等级松贝和青贝的价格相差较大。然而松贝的药效指标是否一定高于青贝？该问题引起了越来越多中药研究人员的重视和关注。在此背景下，本研究以同等级的松贝、青贝为研究对象，利用整体动物实验法来验证松贝和青贝的醇提物、水提物以及粉末的镇咳、平喘、化痰及抗炎作用差异，为下一步的临床试验及深入研究川贝药材商品规格等级划分及合理定价问题提供参考。

1 材料

1.1 仪器

YLS-8A多功能诱咳引喘仪（济南益延科技发展有限公司）；FA1004电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；AUW220D分析天平、2201紫外分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 药品与试剂

松贝、青贝均为一等品（规格：均为每粒约0.17 g），购自成都市荷花池中药材专业市场，经西南医科大学中药资源与鉴定教研室税丕先教授鉴定为真品；氢溴酸右美莎芬片（广州白云山光华制药股份有限公司，批号：20150602，规格：15 mg/片，阳性对照药）；氨茶碱片（国药集团汕头金石制药有限公司，批号：151001，规格：0.1 g/片，阳性对照药）；盐酸氨溴索片（上海勃林格殷格翰药业有限公司，批号：884291，规格：30 mg/片，阳性对照药）；醋酸地塞米松片（广东华南药业集团有限公司，批号：150104，规格：0.75 mg/片，阳性对照药）；氨水（成都市科龙化工试剂厂，批号：2014091001）；磷酸组胺（上海伯奥生物科技有限公司，批号：071025）；酚红（成都市科龙化工试剂厂，批号：131210）；二甲苯（成都市科龙化工试剂厂，批号：20130821）。

1.3 动物

健康SPF级KM小鼠234只（体质量18～22 g，♀♂各半）和健康普通级豚鼠112只（体质量380～400 g，♀♂各半）均由西南医科大学动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK（川）2013-17，使用许可证号：SYXK（川）2013-065。动物购入后常规饲养于室温为（20±2）℃、湿度为50%～60%的动物房内，饲养期间自由摄食和饮水。

2 方法

2.1 药物制备

（1）醇提物制备：分别取松贝、青贝药材各25 g，于45℃干燥24 h后称质量，粉碎成粗粉，以10倍量70%乙醇浸渍48 h后进行渗漉提取，收集初漉液，保存；继续渗漉提取2次，回收乙醇，浓缩干燥，称取醇提物，收率为8.4%。（2）水提物制备：分别取松贝、青贝药材各25 g，于45℃干燥24 h后称质量，粉碎成粗粉，以10倍量蒸馏水煎煮3次，每次1 h，合并3次煎液，浓缩干燥，称取水提物，收率为10.6%。（3）粉末制备：分别取松贝、青贝药材各25 g，于45℃干燥24 h后称质量，全部粉碎成可通过300目筛的微粉，称取药材微粉，收率为90.3%。（4）阳性对照药：分别取相应阳性对照药研磨成极细粉，备用。以上药物均用蒸馏水制备成相应浓度的药液，给药体积均为0.15 mL/10 g。

2.2 动物分组与剂量设计

2.2.1 分组 根据需要进行初筛[4-5]，将合格的小鼠或者豚鼠按体质量和性别随机分为空白对照组（蒸馏水），松贝和青贝的醇提物组、水提物组、粉末组以及阳性对照组，每组10只。

2.2.2 给药剂量设计 参考文献[6]中计算方法并加以改进。2015年版《中国药典》（一部）中川贝用药剂量为3～10 g，成人体质量按60 kg算，小鼠与人的等效剂量换算系数为12.3，豚鼠与人的等效剂量换算系数为4.6，最终以各组数据的几何平均数为各组小鼠、豚鼠的青贝和松贝的给药剂量（小鼠为1.13 g/kg、豚鼠为0.42 g/kg，均以生药量计）；阳性对照药物给药剂量按同样方法计算；空白对照组动物给予相同剂量的蒸馏水。

2.3 止咳实验

参照文献[7-8]方法略加改进。取小鼠按“2.2.1”项下方法分组，按“2.2.2”项下剂量灌胃相应药物，其中阳性对照组小鼠灌胃氢溴酸右美莎芬0.013 g/kg，每天给药1次，连续给药5 d，给药期间小鼠自由进食、饮水。末次给药后30 min，将小鼠放入加有浓氨水（25%）的多功能诱咳引喘仪内，雾化吸入15 s。观察并记录各组小鼠的咳嗽潜伏期（从喷雾开始到小鼠出现咳嗽的时间）和3 min内咳嗽次数（以小鼠腹肌收缩、张口呼吸或发出咳嗽声为判断标准）。

2.4 平喘实验

参考文献[9]方法。取豚鼠按“2.2.1”项下方法分组，按“2.2.2”项下剂量灌胃相应药物，其中阳性对照组豚鼠灌胃氨茶碱0.033 g/kg，每天给药1次，连续给药5 d，给药期间豚鼠自由进食、饮水。末次给药后30 min，定量喷雾2%磷酸组胺引喘15 s，观察记录各组豚鼠的引喘潜伏期[自喷雾开始到哮喘发作（呼吸困难、抽搐甚至跌倒）的时间]和抽搐跌倒只数，超过6 min仍未出现症状者，引喘潜伏期以6 min计。

2.5 化痰实验

参考文献[5，10-11]方法。取小鼠按“2.2.1”项下方法分组，按“2.2.2”项下剂量灌胃相应药物，其中阳性对照组小鼠灌胃盐酸氨溴索21.304 g/kg，每天给药1次，连续给药5 d，给药期间小鼠自由进食、饮水。末次给药后30 min，各组小鼠均按0.1 mL/10 g腹腔注射5%酚红溶液，30 min后将小鼠脱颈处死，分离气管。取甲状软骨下至气管分支处气管，放入装有2 mL生理盐水的试管中，加入0.1 mL氢氧化钠（1 mol/L），用分光光度计（波长为546 nm）测定光密度（OD）值，通过标准曲线计算酚红含量。

2.6 抗炎实验

参考文献[12]方法。取小鼠按“2.2.1”项下方法分组，按“2.2.2”项下剂量灌胃相应药物，其中阳性对照组小鼠灌胃醋酸地塞米松9.225×10－4g/kg，每天给药1次，连续给药5 d，给药期间小鼠自由进食、饮水。末次给药后30 min，用微量移液管将50 μL二甲苯均匀涂抹在小鼠右耳同一位置的内外两侧（各25 μL）。致炎30 min后处死小鼠，沿耳廓基线剪掉双耳，用直径9 mm的耳肿打孔器在双耳同一部位打下圆片，分析天平精密称质量，计算耳肿胀度[耳肿胀度（mg）＝右耳片质量（mg）－左耳片质量（mg）]和耳肿胀抑制率[耳肿胀抑制率（%）＝空白对照组平均耳肿胀度－给药组平均耳肿胀度/空白对照组平均耳肿胀度×100%]。

2.7 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，正态分布的连续变量的组间比较采用LSD检验，非正态分布的组间比较采用秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 止咳实验结果

与空白对照组比较，阳性对照组以及松贝和青贝的醇提物组、粉末组小鼠的咳嗽潜伏期均显著延长，3 min内咳嗽次数均显著减少（P＜0.05或P＜0.01），松贝和青贝的水提物组差异无统计学意义（P＞0.05）。与松贝相同组间比较，青贝醇提物组小鼠咳嗽潜伏期显著延长（P＜0.05），结果见表1。

表1 各组小鼠的咳嗽潜伏期和3 min内咳嗽次数测定结果（±s，n＝10）Tab 1 Determination of coughing latent period and coughing times within 3 min of mice in each group（±s，n＝10）

表1 各组小鼠的咳嗽潜伏期和3 min内咳嗽次数测定结果（±s，n＝10）Tab 1 Determination of coughing latent period and coughing times within 3 min of mice in each group（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与松贝相同组比较，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.corresponding group of F.cirrhosa，#P＜0.05

3 min内咳嗽次数33.24±9.23 20.53±8.11＊27.61±9.62 17.59±8.48＊＊17.92±8.35＊＊28.12±8.06 16.71±8.39＊＊12.76±6.94＊＊组别空白对照组松贝醇提物组松贝水提物组松贝粉末组青贝醇提物组青贝水提物组青贝粉末组阳性对照组（氢溴酸右美莎芬）咳嗽潜伏期，s 25.85±6.72 48.76±18.89＊＊31.83±10.97 59.95±20.25＊＊58.52±20.36＊＊#30.56±10.71 61.38±21.29＊＊68.33±21.47＊＊

3.2 平喘实验结果

给药前，各组豚鼠的引喘潜伏期差异无统计学意义（P＞0.05）。给药后，与空白对照组比较，阳性对照组、松贝和青贝的醇提物组、粉末组豚鼠的引喘潜伏期显著延长（P＜0.05或P＜0.01）；阳性对照组、松贝粉末组和青贝的醇提物、粉末组豚鼠的抽搐跌倒只数显著减少（P＜0.05或P＜0.01）；松贝和青贝的水提物组差异均无统计学意义（P＞0.05）。与松贝相同组间比较，青贝各组豚鼠的引喘潜伏期和抽搐跌倒只数差异均无统计学意义（P＞0.05），结果见表2。

表2 各组豚鼠的引喘潜伏期和抽搐跌倒只数测定结果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of cough induction latent period and the number of guinea pig with convulsive fall in each group（±s，n＝10）

表2 各组豚鼠的引喘潜伏期和抽搐跌倒只数测定结果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of cough induction latent period and the number of guinea pig with convulsive fall in each group（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别空白对照组松贝醇提物组松贝水提物组松贝粉末组青贝醇提物组青贝水提物组青贝粉末组阳性对照组（氨茶碱）引喘潜伏期，s给药前55.90±8.36 55.96±9.32 55.39±7.88 55.61±8.74 54.90±9.03 54.84±8.75 55.45±7.96 54.68±9.12给药后56.23±7.88 71.16±10.39＊63.25±11.73 118.91±14.58＊＊71.26±11.58＊61.86±12.33 119.88±15.13＊＊128.78±16.26＊＊抽搐跌倒数，只10 8 9 5＊＊7＊9 5＊＊3＊＊

3.3 化痰实验结果

与空白对照组比较，各给药组小鼠气管中酚红含量均显著增加（P＜0.05或P＜0.01）；与松贝相同组比较，青贝粉末组小鼠气管中酚红含量差异均无统计学意义（P＞0.05），结果见表3。

表3 各组小鼠的气管酚红含量测定结果（±s，n＝10）Tab 3 Determination of phenol red content in the trachea of mice in each group（±s，n＝10）

表3 各组小鼠的气管酚红含量测定结果（±s，n＝10）Tab 3 Determination of phenol red content in the trachea of mice in each group（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与松贝相同组比较，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.corresponding group of F.cirrhosa，#P＜0.05

组别空白对照组松贝醇提物组松贝水提物组松贝粉末组青贝醇提物组青贝水提物组青贝粉末组阳性对照组（盐酸氨溴索）气管中酚红含量，μg/mL 1.56±0.44 2.15±0.61＊2.42±0.52＊＊2.52±0.58＊＊2.19±0.56＊2.51±0.49＊＊2.60±0.54＊＊2.68±0.57＊＊

3.4 抗炎实验结果

与空白对照组比较，各给药组小鼠的耳肿胀程度均显著减小、耳肿胀抑制率均显著增加（P＜0.05或P＜0.01）；与松贝相同组比较，青贝各组小鼠的耳肿胀度差异均无统计学意义（P＞0.05），结果见表4。

表4 各组小鼠的耳肿胀度和耳肿胀抑制率测定结果（±s，n＝10）Tab 4 Determination of ear swelling degree and inhibitory rate of ear swelling of mice in each group（±s，n＝10）

表4 各组小鼠的耳肿胀度和耳肿胀抑制率测定结果（±s，n＝10）Tab 4 Determination of ear swelling degree and inhibitory rate of ear swelling of mice in each group（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别空白对照组松贝醇提物组松贝水提物组松贝粉末组青贝醇提物组青贝水提物组青贝粉末组阳性对照组（醋酸地塞米松）耳肿胀抑制率，%0 34.20＊40.93＊44.25＊34.12＊41.41＊44.25＊50.25＊＊耳肿胀度，mg 12.34±4.38 8.12±3.61＊7.29±2.63＊6.88±1.57＊8.13±3.56＊7.23±2.48＊6.88±1.52＊6.14±1.55＊

4 讨论

松贝、青贝主要来源于川贝母、暗紫贝母和甘肃贝母等基源植物，分布较广，不同环境条件、生长周期、栽培方法会导致种间、种内变异复杂，鳞茎大小、形态很难区分，以野生为主的松贝、青贝常混在一起采挖出售[13]，导致品种很难鉴别，产地也无法考证，除非采用近红外光谱技术[14]、DNA分子生物学[15]等现代科学技术进行品种分类，这在川贝交易中不易实现，因此给后续质量控制、生产流通及临床应用等增加了不确定性与难度。

中药材常以商品规格等级来鉴别其品种真伪及质量优劣，商品规格是中药材品质的外在表现和标志，是市场流通的表现形式，也是交易定价的依据。从理论上看，药材商品规格等级与其有效成分含量、价格与药效之间应具必然联系，然而事实并非如此。本研究发现，同等级（一等品）的松贝价格比青贝高500元/kg，而青贝的止咳、平喘、化痰、抗炎效果略优于松贝或与之相当。可见，川贝药材的商品规格（松贝、青贝）、市场价格、药效与传统认知存在不一致的情况。由于川贝颗粒大小不同，其有效成分有明显差异[16]，故本研究选用颗粒大小相近的松贝和青贝进行实验。因为川贝传统用药方法是粉末和水煎剂[17]，而成方制剂的提取方式多采用乙醇渗漉法，所以本研究对松贝和青贝的水提物、醇提物和粉末3种给药形式的研究具有一定的依据。本研究还发现，松贝和青贝以全粉入药效果最好，其止咳效果较好；水提物的化痰效果较好，粉末形式的平喘效果较好。因此，笔者建议无论是单味入药还是复方入药，少量用药还是大量成方投料，尽量采用松贝、青贝的粉末形式入药，除非特殊工艺条件要求所需，则根据所需功效选择不同提取物入药。

陈泓竹等[12]研究发现，青贝止咳效果优于松贝，抗炎效果稍次于松贝；杨庆等[18]研究发现，松贝配伍附子在小剂量时镇痛、抗炎效果远低于青贝配伍，剂量增加1倍时，效果略优于青贝配伍；黄雅彬等[19]研究发现，松贝止咳效果优于青贝，抗炎效果次于青贝。但在上述研究中均未明确药材等级，只设计了川贝主要作用中的止咳、抗炎实验。川贝中主要有效成分为生物碱和水溶性非生物碱（如皂苷、核苷、多糖等），不同处理方式会导致不同化学成分含量不一。针对松贝市场价格高于青贝，但其某些化学成分含量低于青贝的问题[20]，笔者引入现代中药整体药效学指标来评价传统经验的正确性。川贝的现行商品规格等级划分标准是否科学还有待商榷，目前主要是以经验感知为依据，且化学成分与药材商品规格存在负相关性[22]，缺乏系统性整理和现代科技的支持。故笔者建议将中药药效学、粒径大小、产量、药源等指标进行客观综合化和精准化评价，正确导向市场交易行为，这对我国中药材商品规格等级标准的研究具有重要意义。

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