2种生防菌对苹果树3种病害病原菌拮抗作用比较

许圆圆　宁娜　李发康　李培　姚杰　薛应钰

摘要：以生防放線菌长枝木霉T6和放线菌ZZ-9为试材，采用圆盘滤膜法和对口培养法比较T6、ZZ-9所产生的代谢物对苹果树腐烂病病菌、苹果树轮纹病病菌和苹果树早期落叶病病菌的拮抗作用，结果表明：长枝木霉T6的非挥发性物质对这3种病原菌抑制效果明显，抑制率分别达到97.50%、83.69%、68.35%。放线菌ZZ-9的非挥发性物质对苹果树腐烂病菌和苹果树轮纹病菌的抑制率达到了96.25%和72.42%%，对早期落叶病菌的拮抗作用较弱，抑制率小于50%。长枝木霉T6和放线菌ZZ-9的挥发性物质对这3种病原菌的拮抗作用不明显，抑制率均小于50%。长枝木霉T6和放线菌ZZ-9对苹果树三种病害的拮抗作用主要由二者所产生的非挥发性物质起作用。

关键词：苹果树；长枝木霉T6；放线菌ZZ-9；腐烂病菌；轮纹病菌；早期落叶病菌；拮抗；非挥发性物质；挥发性物质

中图分类号：S436.611.1 文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2018）11-0024-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.11.008

Comparison of Antagonistic Effects of Two Biocontrol Bacteria on Three Disease Pathogens in Apple Trees

XU Yuanyuan 1， 2， NING Nan 1， 2， LI Fakang 1， 2， LI Pei 1， 2， YAO Jie 1， 2， XUE Yingyu 1， 2

（1. College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070， China； 2. Laboratory of Biological Control of Crop Diseases and Pests， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：With Trichoderma longibrachiatum T6 and actinomycete ZZ-9 as test materials， the disc filter method and the counterculture method were used to compare antagonistic effects of the metabolites produced by the two biocontrol bacteria to the pathogens of valsa mali， apple white rot and Alternaria mali to provide a basis for spatial distribution of pesticides when these two biocontrol bacteria are used as biocontrol agents to control apple tree diseases. The results showed that the non-volatile substances of Trichoderma longibrachiatum T6 inhibited the three pathogens significantly， and the inhibition rates reached 97.50%， 83.69% and 68.35%， respectively. The inhibitory rate of non-volatile substances of actinomycete ZZ-9 against valsa mali and apple white rot reached 96.25% and 72.42%%， and the antagonism of Alternaria mali was weak， and the inhibition rate was less than 50%； The antagonism of the volatile substances of Trichoderma longibrachiatum T6 and actinomycete ZZ-9 on these three pathogens was not obvious， and the inhibition rate was less than 50%. It is concluded that the antagonistic effects of Trichoderma longiflorum T6 and actinomycete ZZ-9 on three diseases of apple trees mainly play a role in the non-volatile substances produced by the two fungi，which provides important theoretical basis for the development of related preparations in the later stage.

Key words： Apple tree； Trichoderma longibrachiatum T6； Actinomycete ZZ-9； Rotten pathogen； Rhizoctonia； Early deciduous fungus； Antagonism； Non-volatile substances； Volatile substances

苹果产业是甘肃省的重要产业之一[1 - 2 ]，苹果树病害的广泛发生是阻碍这一产业良性发展的重要因素[3 - 4 ]。苹果树病害主要有枝干病害、果实病害和叶部病害。苹果树腐烂病和苹果轮纹病这2种病害既危害枝干，又侵染果实，病原属弱寄生菌，具有潜伏侵染特点。苹果树腐烂病病原菌是一种弱寄生菌，对于树势强的树体其侵染后病原菌不易扩展，腐烂病发生不严重。当树势变弱时，其扩展的能力将变强，从而易于发病，且树龄越大侵染和扩展将越容易[5 ]。苹果树腐烂病病原菌生长顽固、反复，对果园有强烈的毁灭性，该病已成为苹果产业的重要病害之一。苹果树轮纹病病原菌不但为害枝干，而且是果实上的重要病原菌。其为害枝干时造成枝干上气孔周围产生瘤状斑，严重时整个枝干树皮变粗糙，最终致使枝干死亡。当其为害果实时，造成轮纹烂果。已有研究表明，苹果树轮纹病菌1a有2个孢子孔口散发高峰期，这2个时期是防治该病的重要时 期[6 ]。苹果树早期落叶病菌侵染苹果树叶片，其危害一是导致叶片脱落，使苹果生长受到抑制，商品率下降；二是由于叶片大量脱落，花芽的分化受到影响，使来年的坐果率下降，影响来年的苹果产量；三是由于叶片是树体产生营养物质的重要来源，叶片生长不良使树势下降，进而引起苹果上其他病害的发生[7 - 8 ]。在苹果树病害的防治中，化学方法防治有作用迅速、方便和防治效果显著的特点。在现代果园的日常维护中，化学防治是苹果树病害防治中最为常用的方法之一[9 ]。但化学药剂的长期、大量使用，导致抗药性的产生，同时造成农药残留和环境污染问题。为此寻找抗性风险低且环境相容性好的生防制剂已是农药开发的重要途径[10 ]，研制出高效的生防制剂来防治苹果树病害将从根本上解决问题[11 ]。

木霉是一种主要分布在土壤中的寄生真菌，对很多病原菌均有良好的抑制作用，且有改良土壤、诱导植物免疫反应的功效[12 ]。木霉主要是通过重寄生、分泌胞外降解酶和产生代谢产物等拮抗作用，抑制病原菌生长[13 ]。有研究表明，长枝木霉T6的抑菌物质主要为邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）、油酸、邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）和芥酸酰胺，其制备的发酵液在日光和紫外光照下稳定，不易分解，其储藏温度没有严格限制[14 ]。景芳等[15 ]通过优化培养基和筛选助剂类型，研制出了长枝木霉T6水分散粒剂，这为长枝木霉T6应用于生产提供了重要依据。放线菌同样为一种分布广泛的微生物，其在土壤和生物体内都有分布，且其对环境兼容性好，对植物病害病原菌有良好抑制作用的同时对植物体低毒。薛应钰等[16 ]对分离自土壤中的放线菌进行筛选，得到了放线菌ZZ-9发酵液，对苹果树腐烂病菌有明显抑制作用，抑制率达到96.4%，并初步鉴定放线菌ZZ-9为娄彻氏链霉菌。已有研究表明，长枝木霉T6和放线菌ZZ-9这两种生防菌的抗菌物质对于环境有着良好的稳定性[17 - 18 ] ，这就意味着这两种菌都有良好的药物开发潜质。

我们通过比较长枝木霉T6和放线菌ZZ-9的非挥发性物质和挥发性物质对苹果树腐烂病菌、苹果树轮纹病菌和苹果树早期落叶病菌的拮抗作用，以期为这2种生防菌作为生防药剂在苹果树上的施药分布提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 长枝木霉T6、放线菌ZZ-9、苹果树腐烂病菌、苹果树轮纹病菌、苹果树早期落叶病菌的菌株均由甘肃农业大学植物保护学院植物病害生物防治实验室提供。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基：马铃薯200 g、琼脂18 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL，pH 7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 2种生防菌非挥发性物质对3种病原菌拮抗作用比较 长枝木霉T6、放线菌ZZ-9的非挥发性物质拮抗作用测定均采用圆盘滤膜法[19 ]。在PDA平板表面平贴1层灭过菌的玻璃纸后接入长枝木霉T6菌饼（d=0.50 cm）；放线菌ZZ-9则是在贴有1层灭过菌的玻璃纸的PDA平板上划线接入，纵横各7条。28 ℃恒温光照条件下培养3 d后将玻璃纸去除，接入苹果树腐烂病菌（苹果树轮纹病菌和苹果树早期落叶病菌按同样方法接入），每组处理设3个重复。以不接长枝木霉T6为对照。每组设3次重复。于培养3 d和5 d时测量记录菌落直径并计算抑制率。抑制率计算公式如下：

抑制率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/（处理菌落直径-5 mm）]×100%

1.2.2 2种生防菌挥发性物质对3种病原菌拮抗作用比较 长枝木霉T6和放线菌ZZ-9的挥发性物质拮抗作用测定采用对口培养法[20 ]。在PDA平板上转接长枝木霉T6菌饼（d=0.50 cm）。放线菌ZZ-9则是在PDA平板上划线接入，纵横各7条。28 ℃恒温无光条件下培养5 d后将灭菌的玻璃纸平铺于菌落表面，另一PDA平板接入苹果树腐烂病菌（苹果树轮纹病菌和苹果树早期落叶病菌相同方法接入），将两平板皿底对接，用封口膜封口，以不接长枝木霉T6的对口平板为对照。每组3次重复。于培养3 d和5 d测量并记录菌落直径并计算抑制率，计算公式同1.2.1。

1.3 数据处理

试验数据利用Excel 2010进行整理，利用DPS7.05软件进行数据显著性分析。

2 結果与分析

2.1 2种生防菌的非挥发性物质对苹果树3种病原菌的拮抗作用

2.1.1 对苹果树腐烂病菌的拮抗作用 从表1、图1可知，长枝木霉T6与放线菌ZZ-9对苹果树腐烂病菌均具有明显的拮抗作用，2种生防菌的非挥发性性物质在3 d和5 d时抑制率均高于95%。方差分析表明，2种生防菌的非挥发性物质在3 d和5 d时对苹果树腐烂病菌的抑制效果均较CK存在极显著差异，但二者的拮抗效果均无明显差异。

2.1.2 对苹果轮纹病菌的拮抗作用 从表2、图2可知，长枝木霉T6和放线菌ZZ-9菌株对苹果树轮纹病菌均有明显拮抗作用，2种生防菌的非挥发性物质在3 d时抑制率分别为97.81%和90.63%，5 d时抑制率分别达到83.69%和72.42%。方差分析表明，2种生防菌的非挥发性物对苹果树轮纹病菌的抑制效果均较CK存在极显著差异，且长枝木霉T6对该病原菌的拮抗效果优于放线菌ZZ-9。

2.1.3 对苹果早期落叶病菌的拮抗作用 从表3、图3可知，长枝木霉T6对苹果树早期落叶病菌的拮抗作用强于放线菌ZZ-9对该菌的拮抗作用，2种生防菌的非挥发性物质在3 d时的抑菌率均大于5 d时的抑菌率，5 d时放线菌ZZ-9对苹果树早期落叶病菌的抑制率小于50%。方差分析结果表明，长枝木霉T6和放线菌ZZ-9对苹果树早期落叶病菌的抑制效果均较CK差异极显著，且长枝木霉T6对该病原菌的拮抗效果优于放线菌ZZ-9。

2.2 2种生防菌的挥发性物质对苹果树上3种病原菌的拮抗作用

2.2.1 对苹果树腐烂病菌的拮抗作用 表4、图4表明，长枝木霉T6的挥发性物质与放线菌ZZ-9的挥发性物质对苹果树腐烂病病原菌的抑制率均小于50%。3 d时长枝木霉T6的挥发性物质对苹果树腐烂病病原菌的抑制率达到40.36%，5 d时抑制率只有18.33%；放线菌ZZ-9的挥发性物质对苹果树腐烂病病原菌的抑制率3 d时为17.94%，5 d时仅为4.28%。方差分析结果表明，放线菌ZZ-9的挥发性物质对苹果树腐烂病病原菌的抑制效果较CK无显著性差异，长枝木霉T6的挥发性物质对苹果树腐烂病病原菌的抑制效果较CK有极显著差异，且长枝木霉T6的拮抗效果优于放线菌ZZ-9。

2.2.2 对苹果轮纹病菌的拮抗作用 从表5、图5可以看出，2种生防菌的挥发性物质对苹果轮纹病病原菌的拮抗作用均不明显，3 d时放线菌ZZ-9的挥发性物质对苹果轮纹病病原菌的抑制率为32.18%，长枝木霉T6的挥发性物质对苹果轮纹病病原菌抑制率为17.81%；5 d时2种生防菌的挥发性物质对苹果轮纹病病原菌的抑制率均在20%以上。方差分析结果表明，长枝木霉T6的挥发性物质与放线菌ZZ-9的挥发性物质对苹果轮纹病病原菌的抑制效果均较CK差异极显著，且长枝木霉T6的拮抗效果在3 d时优于放线菌ZZ-9，5 d 时与放线菌ZZ-9无明显差异。

2.2.3 对苹果早期落叶病菌的拮抗作用 试验结果（表6，图6）表明，2种生防菌的挥发性物质对苹果树早期落叶病菌病原菌均无拮抗作用。3 d时长枝木霉T6的挥发性物质对苹果树腐烂病病原菌的抑制率为5.61%，5 d时抑制率为-1.25%；放线菌ZZ-9的挥发性物质对苹果树腐烂病病原菌的抑制率3 d时为0.56%，5 d时仅为2.92%。方差分析结果表明，长枝木霉T6的挥发性物质和放线菌ZZ-9的挥发性物质对苹果树腐烂病病原菌的抑制效果均与CK无显著差异且二者的拮抗效果也无明显差异。

3 小结与讨论

试验表明，放线菌ZZ-9的2种物质对苹果树早期落叶病菌无明显拮抗作用，而长枝木霉T6的非挥发性物质对该病原菌有明显拮抗作用，在生产中长枝木霉T6可用于早期落叶病的防治。长枝木霉T6与放线菌ZZ-9对枝干病害病原菌有明显拮抗作用，且长枝木霉的拮抗效果要优于放线菌ZZ-9的拮抗效果。但2种抑菌物质相混合是否可增强其拮抗作用有待进一步研究。武汉琴等[21 ]研究表明，长枝木霉可生长在茶树上，且对茶树的生长有一定的促生作用，人工接种后可在新苗上再分离出这种菌，在植物体内定植后，其外界環境对它的影响减弱，更利于其药效的发挥。基于本试验长枝木霉T6对苹果树上3种病原菌较好的拮抗效果，是否可将长枝木霉T6菌株接到苹果树上，利用其自身生长及其所产生的代谢物来抑制苹果树上的病原菌生长，以及接入长枝木霉T6后是否会对苹果树产生不良影响，这有待进一步研究。放线菌ZZ-9有良好的稳定性，有应用于生产的良好条件，但其抑菌物质尚不明确。在范万泽等[22 ]研究放线菌ZZ-9发酵液的抑菌普时，得到放线菌ZZ-9的发酵液对苹果树轮纹病菌的抑制率小于27%，而本试验通过圆盘滤膜法得到其非挥发性物质对苹果树轮纹病菌的抑制率大于70%。这是否是方法不同而造成的抑菌物质浓度差异有待进一步研究。2种生防菌的挥发性物质对苹果轮纹病菌有拮抗作用，但其拮抗作用不明显，若改变其浓度是否可提高其拮抗效果有待进一步研究。本试验仅2种生防菌对这3种病原菌在实验室的拮抗效果，田间试验如何，有待进一步探索。

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（本文责编：郑立龙）