牛乳源金黄色葡萄球菌EsxA蛋白的表达及免疫原性分析

易鸳鸯，赵亚南，马鹏睿，李斌，苏艳

新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052

金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aur eus) 是一种重要的人兽共患化脓性感染病原菌[1]，近年来发现由该菌所致的感染呈逐年增加的趋势，单纯依靠抗生素治疗由其引发的感染变得越来越困难。目前以S. aureus活的或灭活的菌体、细胞壁锚定蛋白、荚膜多糖、外毒素等为靶抗原的疫苗虽可显示出一定的保护作用，但临床效果并不理想[2-3]。

对于新的更有效抗原靶标的发掘和免疫反应类型的研究，必将为有效的S. aureus疫苗的开发带来希望。S. aur eus的 ESAT-6 (Early secreted antigenic target-6 kDa) 分泌系统由 11种蛋白组成，可引发宿主严重炎症和细胞凋亡[4-5]。EsxA蛋白是该系统中一个主要的分泌蛋白，是S. aureus的早期靶向蛋白，可协助S. aureus的逃逸，引起反复与持续性感染[6]。EsxA缺陷株可降低感染小鼠脓肿的形成，该结果也提示 EsxA蛋白在S. aureus致病过程中发挥着重要作用[7-8]。研究表明，EsxA蛋白可诱导宿主的T淋巴细胞增殖活化和细胞因子的产生[9]，Zhang等[10]研究发现，EsxA蛋白可诱导小鼠产生Th1和Th17介导的免疫反应，提示该蛋白在S. aureus疫苗研究中具有潜在发展前景[11]。目前有关S. aureus的EsxA蛋白如何在机体与该菌的相互作用和免疫过程中发挥作用的机制尚不完全清楚。

为更深入、全面地认识和评价 EsxA蛋白在S. aureus免疫过程的作用与特点，本研究表达了牛乳源S. au reus的EsxA重组蛋白，并以该重组蛋白免疫小鼠，分析免疫后特异性IgG抗体亚型的变化规律和特征，通过攻毒后比较分析不同组织脏器的病理组织学变化、各组织荷菌数的变化及对小鼠的免疫保护效果，综合评价了 EsxA蛋白的免疫原性。该研究结果将为新型、高效、安全的S. aureus疫苗研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒及菌株

牛乳源S. aureus分离株GW20-2由新疆农业大学动物医学学院微生物实验室分离鉴定并保存。原核表达载体pET-28a(＋)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)均由本室保存。

1.2 主要试剂

DL2000 DNA marker、DL5000 DNA marker、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；Ni-NTA Resin购自北京全式金生物技术公司；山羊抗鼠HRP-IgG、山羊抗兔HRP-IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TMB显色液、DAB显色液购自北京索莱宝科技有限公司。兔抗S. aureus多克隆抗体由本室用灭活S. aureus全菌免疫实验兔制备。

1.3 实验动物

18−20 g雌性昆明白小鼠购自新疆维吾尔自治区动物疾病控制中心。将42只小鼠随机分为3组，每组14只：EsxA免疫组、灭活全菌免疫组和PBS对照组。

1.4 EsxA基因的扩增及重组表达质粒的构建

根据GenBank中S. aureus的EsxA基因序列(JOVN01000006.1) 设计引物，上游引物 P1：5′-GCGGAATTC ATGGCAATGATTAAGATGAGT CC-3′ (下划线处为EcoRⅠ酶切位点)，下游引物P2：5′-TAACTCGAGTTTGCAAACCGAAATTAT TAG-3′ (下划线处为XhoⅠ酶切位点)。预期扩增片段为 294 bp，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

以S. aureus分离株基因组为模板，扩增获得目的基因EsxA。反应体系：Taq酶 0.25 μL、Taq缓冲液Ⅱ2.5 μL 、25 mmol/L MgCl22.5 μL、dNTPs(各 25 mmol/L) 4 μL、上下游引物各 0.5 μL、模板DNA 1 μL，加 ddH2O 至 25 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸15 min。EsxA和pET-28a(＋)载体分别经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切，用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，PCR鉴定后挑取阳性克隆送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序。

1.5 重组蛋白EsxA的诱导表达及纯化

将测序正确重组质粒转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞中，挑取单菌落接种于含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37 ℃振荡培养，至OD600为 0.6时加入 IPTG至终浓度1 mmol/L，30 ℃诱导表达5 h，离心收集菌体，超声破碎菌体。用 Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白质，进行SDS-PAGE分析。

1.6 重组蛋白EsxA的Western blotting分析

将纯化后的EsxA蛋白转移到NC膜，4 ℃过夜封闭，用兔抗S. aureus多克隆抗体 (1∶300稀释) 为一抗，37 ℃孵育1 h，清洗后用HRP标记山羊抗兔IgG (1∶1 000稀释) 为二抗，37 ℃孵育1 h，清洗后用DAB显色液显色。

1.7 小鼠免疫

将纯化的EsxA蛋白按1∶1体积比与弗氏佐剂乳化，皮下注射免疫小鼠，共免疫 2次 (初次免疫加弗氏完全佐剂，第2次免疫加弗氏不完全佐剂)，EsxA免疫组的剂量为50 μg，灭活全菌组免疫剂量为 0.6×107CFU，PBS对照组注射量为100 μL，初次免疫后3周进行第2次免疫，第2次免疫剂量同第一次免疫剂量。初次免疫后0、14、35、42 d断尾采血，分离血清备用。

1.8 免疫小鼠抗体水平及抗体亚型的检测

用间接ELISA方法检测多克隆抗体亚型。用纯化后的EsxA重组蛋白包被ELISA板，100 ng/孔，4 ℃过夜。37 ℃封闭1 h，将梯度稀释的各免疫组小鼠血清加入孔中，37 ℃作用1 h，加入1∶4 000稀释HRP 标记的羊抗鼠 IgG、IgG2a、IgG1，100 μL/孔，37 ℃作用30 min，洗涤5次，用TMB显色15 min，最后用1 mol/L硫酸终止反应，测定OD450值。

1.9 小鼠攻毒试验

首次免疫后第42天，对小鼠腹腔接种S. aureus分离株GW20-2，每只小鼠攻击菌量为1×108CFU，攻毒后连续14 d观察并记录小鼠的发病和死亡情况，并计算保护率。

1.10 病理组织学观察

攻毒后第10天，分别取各试验组小鼠肝、脾和肾组织置于10%福尔马林溶液中固定，制作石蜡切片，HE染色，观察各脏器的病理组织学变化。

1.11 菌体载量检测

攻毒后第3天，处死实验组及空白组小鼠各3只，将死亡小鼠无菌条件下剖检取出其肝、脾和肾并称其重量；加入灭菌生理盐水进行充分研磨，梯度稀释后涂布于固体培养基，每个稀释度3个重复，37 ℃倒置培养12 h；对培养结果进行细菌计数。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白的表达及纯化

SDS-PAGE结果显示，转化后大肠杆菌BL21(DE3) 经IPTG诱导后在16.7 kDa左右处有明显的蛋白带 (图 1)，大小与预期一致，纯化的结果也表明EsxA重组蛋白表达成功。

2.2 重组蛋白的Western blotting分析

将纯化的EsxA重组蛋白进行 Western blotting分析，结果显示诱导表达并纯化的 EsxA重组蛋白能够与兔抗S. aureus血清发生特异性反应 (图2)，表明该重组蛋白有良好的抗原性。

2.3 EsxA免疫小鼠后的抗体检测

2.3.1 IgG的检测

用间接ELISA对小鼠第2次免疫后抗体的检测结果表明，免疫组小鼠的 EsxA特异性抗体水平与对照组相比明显升高 (P<0.01)，且免疫后抗体随免疫时间增加呈上升趋势 (图3A)，EsxA免疫组诱导的抗体水平低于灭活全菌免疫组，显示其具有一定的抗体诱导能力 (图3B)。

图1 重组蛋白EsxA的SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of recombinant protein EsxA. M: protein marker; 1: recombinant bacterial extract before induction; 2: recombinant bacterial extract after induction; 3: supernatant after ultrasonic disruption;4: pellets after ultrasonic disruption; 5–6: purified recombinant protein.

图2 重组蛋白EsxA表达后的Western blotting分析Fig. 2 Western blotting analysis of the expressed recombinant protein EsxA. M: prestained protein marker;1: purified protein EsxA; 2: negative control.

2.3.2 小鼠血清抗体亚型的检测

ELISA检测结果表明，免疫后各免疫组小鼠血清中都产生了特异性抗体IgG1和IgG2a。EsxA免疫组小鼠血清中的抗体亚型以 IgG1为主，且IgG1抗体水平显著高于灭活全菌免疫组及对照组 (图 4，P<0.05)。

2.3.3 小鼠免疫保护力检测

首次免疫后第 42天，以S. aur eus菌株GW20-2对小鼠攻毒并观察14 d。结果显示，PBS对照组全部死亡，灭活全菌免疫组的保护率为87.5%，EsxA免疫组的保护率为75% (图5)。

图3 免疫小鼠的血清IgG检测Fig. 3 Serum IgG detection of immunized mice. (A)Antibody level changes of immunized mice. (B) Serum antibody titers detection of immunized mice. Different minuscule letters means significant difference P<0.05,Different capital letters means extremely significant difference, P<0.01.

图4 免疫小鼠血清抗体亚型的检测结果Fig. 4 Detection results of serum antibody subtype levels of immunized mice. (A) Detection of serum IgG1 of different immunization groups. (B) Detection of serum IgG2a of different immunization groups. Different minuscule letters means significant difference P<0.05, Different capital letters means extremely significant difference, P<0.01.

2.3.4 病理组织学观察

攻毒后第 10天对小鼠不同组织进行病理组织学观察。

脾脏：与未攻毒对照组相比，攻毒对照组小鼠脾脏内出现了结缔组织增生和出血现象，可观察到红细胞的群集。灭活全菌免疫组小鼠的脾脏变化不明显，EsxA免疫组小鼠的脾脏出现出血(图 6)。

图5 免疫小鼠攻毒保护力检测Fig. 5 Detection of survival rate of immunized mice following challenge.

图6 各组小鼠脾脏病理组织学变化 (HE染色，400×)Fig. 6 Histological changes of spleens from mice of various groups (HE staining, 400×). (A) No challenge control group.(B) S. au reus challenge group. (C) Recombinant protein EsxA immunized group. (D) Inactivated whole bacteria immunization group.

肾脏：与未攻毒对照组相比，攻毒组小鼠出现了明显的肾间质充血、水肿，肾小管水肿。灭活全菌免疫组和 EsxA免疫组小鼠肾间质充血、水肿现象有所减轻(图7)。

肝脏：与未攻毒对照组相比，攻毒组小鼠出现了肝脏胆汁外泄、肝细胞颗粒变性、肝细胞溶解、坏死。灭活全菌免疫组和 EsxA免疫组小鼠肝脏胆汁外泄、肝细胞颗粒变性、肝细胞溶解、坏死有减轻，病理变化有明显差异(图8)。

图7 各组小鼠肾脏病理组织学变化(HE染色，400×)Fig. 7 Histological changes of kidneys from mice of various groups (HE staining, 400×). (A) No challenge control group. (B) S. au reus challenge group. (C) Recombinant protein EsxA immunization group. (D) Inactivated whole bacteria immunization group.

图8 各组小鼠肝脏病理组织学变化 (HE染色，400×)Fig. 8 Histological changes of livers from mice of various groups (HE staining, 400×). (A) No challenge control group.(B) S. au reus challenge group. (C) Recombinant protein EsxA immunized group. (D) Inactivated whole bacteria immunization group.

2.3.4 荷菌数检测

对小鼠攻毒后第3天，检测小鼠脾脏、肾脏和肝脏组织荷菌数 (图 9)。结果表明，灭活全菌免疫组和 EsxA免疫组小鼠脾脏、肾脏和肝脏组织荷菌数均显著低于对照组，EsxA免疫组小鼠脾脏组织荷菌数明显低于全菌免疫组，该结果与脾脏的病理组织学观察结果一致。

3 讨论

高致病性的金黄色葡萄球菌威胁人类和动物的健康，不仅可导致严重的感染，在世界范围内造成巨大的损失，且该类感染具有治愈率低、反复发生等特点[12]。在S. aureus新型疫苗研发中，抗原的选择非常重要。S. aureus的致病性由许多不同因子决定[13]，以往对S. aureus研究的过程中已证明了该菌的多种黏附因子在该菌感染时和免疫逃避中发挥重要作用，这些黏附分子在免疫后也可诱导机体产生抵抗S. aureus感染的抗体[14]。以往实验证据也表明，在对实验动物以S. aur eu攻击时，单一抗原往往不能提供完全的保护[15-16]。基于S. aur eu黏附因子的研究表明，应当重视S. aureu多种抗原成分的研究应用，同时注意其免疫反应的类型，例如对Th17和Th1介导的免疫反应的诱导与调节[17-18]。

EsxA是S. aureus的ESX系统的一个早期蛋白[19]，是该菌的重要毒力因子[20-21]，已被证明与该菌感染过程中的脓肿形成有关[22]。近期研究发现S. aur eus分泌的 EsxA是与结核分枝杆菌ESAT-6序列同源的一种蛋白[23]。目前结核杆菌的ESAT-6、CFP-10已被作为非常有潜力的抗结核亚单位疫苗进入临床测试，并基于这两种分子形成了商业化的检测技术[24]。国内学者将结核分枝杆菌mpt59和EsxA蛋白融合表达，并将该融合蛋白初步用于结核患者的快速诊断，证明其诊断结核的敏感性为97.8%，特异性为100%[25]。

本研究成功表达与纯化了牛乳源S. aureus的EsxA蛋白，该重组蛋白可与该菌阳性血清特异性结合，免疫小鼠可有效诱导特异性抗体，抗体效价可达1∶900，表明该蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。本研究中我们将 EsxA蛋白与灭活全菌抗原分别进行免疫进行对比后发现，EsxA蛋白免疫可在该菌对脾脏的感染定植方面表现出优于灭活全菌免疫的特点，也进一步证明了对该菌的有效免疫中多种抗原成分应用的必要性。

图9 各组小鼠的脾、肾和肝脏组织荷菌数检测Fig. 9 Detection of bacterial loads from mice of various groups.

Zhang等[9]发现重组的EsxA和EsxB蛋白用于免疫小鼠，可显著提高小鼠对S. aureus的免疫力，且证明了其可诱导 Th17(T-helper 17)及IL17(Interleukin 17) 介导的免疫反应。本研究中用 EsxA免疫小鼠后分析其诱导的抗体类型，结果表明，EsxA重组蛋白和灭活全菌免疫组小鼠IgG1的抗体水平显著高于 IgG2a的抗体水平，EsxA重组蛋白和灭活全菌免疫小鼠后主要诱导产生了以Th2为主的体液免疫应答，EsxA蛋白在诱导IgG1型抗体反应方面优于灭活全菌菌苗。本研究的结果也表明，EsxA重组蛋白也能诱导一定水平的 IgG2a 抗体的产生，但与对照组差异不显著。

Wang等[20]推测，EsxA具有开发为预防S. aureus感染疫苗的潜力，其可能成为针对该菌感染非常有效的疫苗靶标。本研究中我们发现，用 EsxA免疫后攻毒，小鼠肝、脾和肾脏的菌体定植均低于未免疫对照组，尤其是小鼠脾脏中S. aureus的计数显著低于灭活全菌免疫组，该结果表明EsxA是一种有潜力和有价值的免疫靶标。尽管本研究中EsxA蛋白诱导特异IgG1型抗体水平灭活全菌菌苗，但免疫后的攻毒保护力却低于灭活全菌菌苗，我们对该研究结果分析认为，在S. aureus免疫中可能非抗体依赖的免疫保护和多种抗原成分的参与会发挥重要的保护作用，这一点与Misstear等[26]的论点是一致的。

本研究中 EsxA免疫组与灭活全菌免疫组相比，在免疫保护力上虽未显出明显优势，但具有能控制疾病的发生和严重程度的独特优势。

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