ADAMTS5表达状态与胃癌临床病理及预后的关系

黄进团 陈春宇 李森茂 陈浩 廖艺 林锋 杨祖立

中山大学附属第六医院（广东省胃肠肛门医院）胃肠外科（广州 510655）

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，东亚地区尤其是我国胃癌发病率较高［1-2］。尽管以手术为主的综合治疗手段取得较大进步，但胃癌患者的总体预后仍较差。较低的早期诊断率及进展期胃癌较高的局部复发率和远处转移率是我国胃癌患者预后较差的主要原因。因此，进一步研究胃癌发生发展的机制，寻找胃癌发生发展关键靶点，对提高胃癌早期诊断及开发新的治疗方法具有重要意义。含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS）属于Zn2+依赖的金属蛋白酶家族，该家族包含19个成员，研究发现它们参与多种生物学行为，包括组织形态发生、病理生理重构、炎症、血管生成、恶性肿瘤等［3-4］。ADAMTS5基因位于21号染色体（21q21.3），编码930个氨基酸［3］。据报道，ADAMTS5能抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，并具有抗血管生成作用［5］。另外，ADAMTS5在人肝细胞癌中低表达，通过下调VEGF而抑制细胞迁移［6］。然而，也有报道ADAMTS5在人恶性胶质瘤［7］和人非小细胞肺癌［8］中高表达，促进细胞侵袭迁移。我们在前期研究中发现ADAMTS5在人结直肠癌组织中低表达，并能抑制肿瘤细胞迁移侵袭［9］。然而，ADAMTS5在胃癌中的表达及作用尚不明确。因此本研究采用免疫组化方法检测ADAMTS5蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达情况，分析ADAMTS5表达状态与胃癌临床病理特征及总生存期的相关性，探讨其在胃癌发生发展中的作用，以期寻找新的潜在胃癌诊断及判断预后的分子标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集中山大学附属第六医院2007年12月至2012年3月经手术切除且病理确诊的176例胃癌患者的癌组织及24例癌旁正常组织石蜡标本。按照2010年AJCC第七版TNM分期标准进行病理分期。术后随访资料来源于电话随访、住院、门诊病历，随访截止时间为2017年12月31日，随访时间1～123个月，中位随访时间52个月。本研究着重研究患者的总体生存期（overall survival，OS），OS为自手术日期至死亡或随访结束日期。

1.2 主要试剂兔抗人ADAMTS5多克隆抗体（英国Abcam公司），免疫组织化学试剂盒、浓缩型DAB显色试剂盒、苏木素染色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 主要设备仪器奥林巴斯正置显微镜（日本Olympus公司），组织芯片仪（法国Alphelys公司）。

1.4 组织芯片制作组织芯片采用组织芯片仪制作，见参考文献［10］。

1.5 免疫组化染色及结果判断将制作好的组织芯片性4 μm连续切片。在55℃恒温箱中烘烤3 h，常规脱蜡、脱水及Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0）中行微波抗原修复，滴加ADAMTS5一抗稀释液（1∶200）置于4℃冰箱孵育过夜；滴加二抗工作液于常温孵育30 min，滴加DAB显色液显色1 min，苏木素复染2 min，脱水、透明、干燥后中性树脂封片。以PBS代替一抗，其余步骤与上述一致的组织切片作为阴性对照。结果判断参照参考文献［11］。每例标本均按阳性着色强度和阳性细胞百分比进行评分。阳性着色强度分为4个等级：未着色（阴性）、浅黄色（弱阳性）、棕黄色（中等阳性）、褐色（强阳性）依次评分为0、1、2、3分；阳性细胞百分比评分分为5个等级：无阳性细胞为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%以上为4分。免疫染色总分=阳性着色强度×阳性细胞百分比评分。在100倍光学显微镜下对每例标本进行评分，每张芯片均行独立、两重复试验，并取平均数作为每例标本的得分。总分范围0～12分，＜3.5分为ADAMTS5阴性，≥3.5分为ADAMTS5阳性。免疫组化评分采用双盲法由两位病理学专业人员独立判定。

1.6 统计学方法使用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验或Fisher精确概率法；使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用Log-rank检验；单因素及多因素Cox比例风险回归模型用于评估预后相关因素，检验水准α=0.05。以P＜005为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌及癌旁正常组织中ADAMTS5蛋白的表达如图1所示，ADAMTS5蛋白表达主要位于胃癌细胞和胃正常黏膜上皮细胞的细胞质。胃癌组织中ADAMTS5的阳性率为46.6%（82/176），癌旁正常组织中ADAMTS5的阳性率为87.5%（21/24），差异有统计学意义（χ2=14.15，P＜0.001）。

图1 ADAMTS5蛋白在癌旁正常组织和胃癌组织中的表达（免疫组织化学染色，×200，×400）Fig.1 Expression of ADAMTS5 in adjacent normal tissues and gastric cancer tissues（immunohistochemistry staining，× 200，× 400）

2.2 ADAMTS5蛋白在胃癌组织中的表达与临床病理特征的关系ADAMTS5在胃癌组织中的表达状态与性别、组织学类型、肿瘤分化程度、远处转移、TNM分期和脉管浸润相关（表1）。ADAMTS5在男性患者中的表达高于女性患者；管状或乳头状腺癌ADAMTS5表达高于印戒细胞癌；高中分化胃癌ADAMTS5表达高于低分化胃癌；无远处转移者ADAMTS5表达高于有远处转移者；TNMⅠ/Ⅱ胃癌ADAMTS5表达高于Ⅲ/Ⅳ期胃癌；无脉管浸润者ADAMTS5表达高于有脉管浸润者。上述差异均有统计学意义（P＜0.05）。而胃癌组织中ADAMTS5的表达状态与年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、T分期及N分期无关（P＞0.05）。

表1 ADAMTS5在胃癌组织中的表达与临床病理特征的关系Tab.1 The relationship of expression of ADAMTS5 in GC and clinicopathological characteristics

2.3 ADAMTS5蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌患者总生存期的关系生存分析结果提示，ADAMTS5蛋白阳性患者1、3和5年总生存率分别为90.6%、78.3%和69.4%，ADAMTS5蛋白阴性患者1、3和5年总生存率分别为80.3%、54.6%和44.7%。ADAMTS5蛋白阳性患者总生存率显著高于阴性者，差异具有统计学意义（χ2=10.36，P=0.001），见图2。

图2 不同ADAMTS5蛋白表达组胃癌患者总生存期比较Fig.2 Overall survival for the GC patients according to ADAMTS5 expression levels

单因素分析显示，胃癌患者的预后与T分期（95%CI：2.409～18.258，P＜0.001）、N分期（95%CI：1.971～9.483，P＜0.001）、M 分期（95%CI：2.383～6.917，P＜0.001）、脉 管 浸 润（95%CI：1.843～5.213，P＜0.001）和ADAMTS5的表达状态（95%CI：0.264～0.736，P=0.002）密切相关。而Cox多因素回归分析结果显示，ADAMTS5表达状态（95%CI：0.350～0.968，P=0.037）、肿瘤T分期（95%CI：1.383～11.455，P=0.01）和M分期（95%CI：1.259～3.966，P=0.006）是影响胃癌患者总生存时间的独立因素。

3 讨论

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，我国新发胃癌病例约占全世界的一半。我国胃癌发病率高，早期诊断率低，总体治疗效果仍较差，严重威胁我国居民健康。尽管近年来对胃癌的临床病理特征及发生发展机制的研究取得了较大进步，以外科手术治疗为主，辅助放化疗及靶向治疗的综合治疗手段使胃癌总体治疗效果有较大提升，但进展期胃癌仍有较高的复发转移率，晚期胃癌治疗有效率低［12］，大大降低胃癌总体治疗效果。随着对调节胃癌发生发展的信号转导通路的进一步认识，目前已有上市或仍处于临床研究的靶向药物应用于晚期胃癌的治疗，且取得一定的治疗效果［13-14］。因此，进一步研究胃癌的发生发展机制，寻找胃癌发生发展关键靶点，对提高胃癌治疗效果具有重要意义。

ADMATS5首次于1999年发现，并被证实是骨关节炎病理过程中的一个关键酶，通过降解蛋白多糖发挥作用［15］。随着研究的进展，越来越多证据表明ADAMTS5也在其他病理生理进程中发挥重要作用，包括肿瘤［16］。ADAMTS5在肿瘤中的表达及作用呈双向性。如人肝细胞癌［6］及结直肠癌［9］中ADAMTS5低表达且发挥抑癌基因作用，但在人恶性胶质瘤［7］及非小细胞肺癌［8］中ADAMTS5高表达并能促进肿瘤侵袭转移。这提示ADAMTS5在恶性肿瘤的调节中具有多样性及复杂性。

本研究通过对176例胃癌患者术后病理标本的免疫组化检测结果显示，ADAMTS5在胃癌组织中的表达显著低于癌旁正常胃黏膜组织中的表达；而且通过对患者的临床病理资料的分析得出，ADAMTS5在胃癌组织中的表达下调与患者性别、病理学类型、肿瘤分化程度、远处转移、TNM分期、脉管浸润及不良预后相关，提示ADAMTS5可能参与胃癌的发生发展，并可能作为胃癌的一个潜在治疗靶点。

胃癌肿瘤细胞的高侵袭转移性是进展期胃癌总体治疗效果较差的主要原因［17］。我们发现ADAMTS5表达跟远处转移、脉管浸润相关，有远处转移、脉管浸润的胃癌组织中ADAMTS5表达下调，提示ADAMTS5可能抑制胃癌的侵袭转移。这与我们的前期研究中ADAMTS5抑制结直肠癌细胞侵袭转移［9］及既往报道中ADAMTS5抑制人脐静脉内皮细胞迁移［6］的结果一致。然而，与之相悖的是，ADAMTS5能促进人恶性胶质瘤［7］及人非小细胞肺癌［8］的侵袭转移，其中具体的作用机制尚不明确。其可能的机制是，ADAMTS5可通过基质金属蛋白酶依赖性和非依赖性的方式参与对细胞功能的调节，而这两种作用方式的结果可能是不一致的。此两种调节方式也见于ADAMTS家族的其他成员，如 ADAMTS15［18］。而 ADAMTS5 如何调节胃癌的侵袭转移，以及对胃癌其他生物学行为的影响，尚需通过构建ADAMTS5过表达及沉默表达的胃癌细胞株进行体外实验或动物实验进行深入研究。

综上所述，ADAMTS5在胃癌组织中表达低于癌旁正常组织，且与原发胃癌患者性别、病理学类型、肿瘤分化程度、远处转移、TNM分期、脉管浸润及预后相关，提示ADAMTS5可能参与胃癌的发生发展，并可能作为胃癌诊断及治疗的潜在靶点。

［1］TORRE L A，BRAY F，SIEGEL R L，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［2］LEUNG W K，WU M S，KAKUGAWA Y，et al.Screening for gastric cancer in Asia：current evidence and practice［J］.Lancet Oncol，2008，9（3）：279-287.

［3］PORTER S，CLARK I M，KEVORKIAN L，et al.The ADAMTS metalloproteinases［J］.Biochem J，2005，386（Pt 1）：15-27.

［4］KELWICK R，DESANLIS I，WHEELER G N，et al.The ADAMTS（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs）family［J］.Genome Biol，2015，16：113.

［5］KUMAR S，SHARGHI-NAMINI S，RAO N，et al.ADAMTS5 functions as an anti-angiogenic and anti-tumorigenic protein independent of its proteoglycanase activity［J］.Am J Pathol，2012，181（3）：1056-1068.

［6］LI C，XIONG Y，YANG X，et al.Lost expression of ADAMTS5 protein associates with progression and poor prognosis of hepatocellular carcinoma［J］.Drug Des Devel Ther，2015，9：1773-1783.

［7］NAKADA M，MIYAMORI H，KITA D，et al.Human glioblastomas overexpress ADAMTS-5 that degrades brevican［J］.Acta Neuropathol，2005，110（3）：239-246.

［8］GU J，CHEN J，FENG J，et al.Overexpression of ADAMTS5 can regulate the migration and invasion of non-small cell lung cancer［J］.Tumour Biol，2016，37（7）：8681-8689.

［9］LI J，LIAO Y，HUANG J，et al.Epigenetic silencing of ADAMTS5 is associated with increased invasiveness and poor survival in patients with colorectal cancer［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2018，144（2）：215-227.

［10］HUANG J，BAI Y，HUO L，et al.Upregulation of a disintegrin and metalloprotease 8 is associated with progression and prognosis of patients with gastric cancer［J］.Transl Res，2015，166（6）：602-613.

［11］许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准［J］.中国癌症杂志，1999，6（4）：229-231.

［12］张娣，孙亦挺，赵泽毅，等.精准医疗时代的晚期胃癌综合治疗［J］.中国癌症防治杂志，2017，9（5）：361-367.

［13］肖子理，沈志勇，倪醒之.胃癌的分子靶向治疗研究进展［J］.实用医学杂志，2009，25（14）：2207-2209.

［14］吴珍珍.酪氨酸激酶抑制剂治疗晚期胃癌的新进展［J］.实用医学杂志，2015，31（10）：1718-1720.

［15］VERMA P，DALAL K.ADAMTS-4 and ADAMTS-5：key enzymes in osteoarthritis［J］.J Cell Biochem，2011，112（12）：3507-3514.

［16］CAL S，LOPEZ-OTIN C.ADAMTS proteases and cancer［J］.Matrix Biol，2015，44-46：77-85.

［17］HARTGRINK H H，JANSEN EPM，VAN GRIEKEN NCT，et al.Gastric cancer［J］.Lancet，2009，374（9688）：477-490.

［18］KELWICK R，WAGSTAFF L，DECOCK J，et al.Metalloproteinase-dependent and-independent processes contribute to inhibition of breast cancer cell migration，angiogenesis and liver metastasis by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-15［J］.Int J Cancer，2015，136（4）：E14-26.