高效液相色谱串联质谱法测定豆芽中4种药物残留

（宁夏回族自治区食品检测中心，宁夏银川750001）

豆芽是深受广大消费者欢迎的食品，具有较高的营养价值。近年来，市场上曝光市场豆芽存在质量安全隐患[1-3]，同时在执法检查中发现部分豆芽生产者为缩短生产周期、增加产量、改善豆芽外观，在生产黄豆芽、绿豆芽、豆苗的过程中非法添加“AB粉”、“无根豆芽素”等化学物质的现象，滥用的植物生长调节剂会给健康带来风险，已成为目前食品安全领域的一个重大问题[4]。国家食品药品监督管理总局、农业部、国家卫生和计划生育委员会2015年11号公告明确规定在豆芽生产过程中不得使用4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素等物质。

目前，国内外有关4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素等物质检测方法主要以气相色谱法[5]、液相色谱法[6]和色谱－质谱联用法[7-9]为主。不同的检测方法具有其特定的优缺点：运用气相色谱法（gas chromatography，GC）和气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）时通常要进行衍生化的复杂操作，且存在定性不足和灵敏度低等问题；液相色谱法不需要衍生处理，但同样存在选择性差、灵敏度低、易受复杂样品基质干扰且难以实现确证分析等问题。高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）具有高特异性和高灵敏度，是目前广泛应用的检测方法。本试验通过优化质谱参数和色谱条件，考察流动相、提取方法和基质效应等因素，建立HPLC-MS/MS法结合分散萃取技术同时测定豆芽中4种药物残留，该方法准确可靠，回收率稳定，能满足日常豆芽药物残留的检测要求。为严厉打击豆芽违法添加禁限用物质的行为，实现对豆芽生产及市场的有效监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆芽：市售。

赤霉素（gibberellic acid，GA3）、6-苄基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-AB）、4-氯 苯 氧 乙 酸 （4-chlorophenoxyacetic acid，4-CPA）、2，4- 滴 （2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）：德国 Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均大于98%；甲醇、乙腈（色谱纯）：赛默飞世尔科技有限公司；C18、硫酸镁：适用于QuEChERS方法的填料，美国安捷伦公司；甲酸（色谱纯）、乙酸铵（优级纯）、冰乙酸（优级纯）：德国SIGMA公司；氯化钠（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司；所有用水均为超纯水。

Aglient6460三重四级杆质谱：配Aglient 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；IKA T25数显型分散机：德国IKA公司；BUCHI V-850旋转蒸发仪：瑞士步琦实验室公司；BS224电子天平：赛多利斯科学仪器公司；HGC-24方形干式加热氮吹仪：北京恒奥德仪器仪表有限公司；3-15高速离心机：德国Sigma公司。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取适量赤霉素、6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴标准品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的标准储备液；分别移取标准储备溶液适量用甲醇稀释成10.0 μg/mL的混合标准中间溶液；准确移取混合标准中间溶液适量用空白基质提取液稀释成浓度为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L 系列标准工作溶液。

1.3 样品前处理

1.3.1 试样制备

取200 g左右样品加入等质量的去离子水，经均质机均质并混合均匀后，应立即测定。

1.3.2 试样溶液的制备

称取混合均匀的豆芽样品10 g（精确至0.01 g）于100 mL离心管中，加入15 mL 5%乙酸乙腈，涡旋混匀，10 000 r/min匀浆提取1 min，加入2 g氯化钠，再匀浆1 min。在4℃条件下8 000 r/min冷冻离心5 min，上清液备用。

1.3.3 净化

准确称取0.15 gC18和0.90 g硫酸镁于15 mL离心管中，涡旋混匀。加入5.0 mL上清液，涡旋1 min，去除杂质，在4℃条件下8 000 r/min冷冻离心5 min。取出后放置室温，再取上清液1.0 mL于50℃下氮吹至干，准确加入1.0 mL流动相溶解，过0.22 μm滤膜后供高效液相色谱-串联质谱仪分析测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18，2.1（内径）mm 100 mm，粒径 3.5 μm；进样量：10 μL；柱温：30.0 ℃；流速：0.30 mL/min；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵-0.05%甲酸水溶液，B为乙腈。梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase composition for linear gradient elution

1.4.2 质谱条件

离子源：AJS ESI源；扫描方式；负模式；检测方式：多反应监测（multiple reactions monitoring，MRM）；雾化气压力：3.1 bar；喷嘴电压：500 V；干燥气温度与流速：325℃，7 L/min；鞘气温度与流速：375℃，11 L/min；毛细管电压：3 000 V。豆芽中4种药物残留的定量和定性离子、碰撞能量和碎裂电压等参数见表2。

表2 豆芽中4种添加物的质谱分析参数Table 2 MS/MS parameters for four additives in bean sprouts

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

由于4-氯苯氧乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸和赤霉素的分子结构中均含有羧基；6－苄氨基嘌呤可产生[M+H]＋离子，也可以形成稳定的[M+H]－离子。因此采用负离子方式对4种添加物进行电离。分别对浓度为1.0 μg/mL的目标化合物进行单针进样，优化其质谱条件。当目标化合物进入一级质谱后，可产生稳定的[M+H]离子[10]。确定母离子后，在SIM模式下优化各目标化合物的碎裂电压。母离子进入二级质谱，产生不同的离子碎片。在子离子扫描模式下，优化碰撞能量，得到相应的离子碎片。4种添加物的二级离子质谱图见图1，MRM色谱图见图2。

图1 豆芽中4种添加物的二级离子质谱图Fig.1 MS/MS spectra for four additives in bean sprouts

图2 豆芽中4种添加物的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms for four additives in bean sprouts

2.2 色谱条件优化

赤霉素、6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴在不同的流动相中分离程度不同，对比3种流动相甲酸水溶液、乙酸铵水溶液、乙酸铵-甲酸水溶液。通过试验，各待测物在乙酸铵-甲酸水溶液流动相中的分离程度及峰形较好。因此选择5 mmol/L乙酸铵-0.05%甲酸水溶液和乙腈为流动相；在ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱通过梯度洗脱对4种添加物进行分离，目标化合物的保留时间为2 min～7 min之间。

2.3 样品前处理条件的确定

2.3.1 提取溶剂的选择

对比乙腈、含2%乙酸乙腈、含5%乙酸乙腈3种溶液作为提取溶剂时，各待测物的回收率。其中含5%乙酸乙腈溶液做为提取溶剂时，回收率最高。

2.3.2 净化条件的优化

分别在 MgSO4+C18、C18+PSA、MgSO4+C18+Carbon 3种净化条件下进行试验，不同净化材料可以选择性地保留基质干扰成分，达到净化效果。但使用PSA和Carbon时对目标物也有一定的吸附，回收率偏低。最终采用MgSO4+C18作为净化剂时，各待测物的回收率较高。

2.4 基质效应

基质效应是在提取基质中的目标物时，基质中的干扰物影响目标化合物的离子化，使得目标化合物在仪器上的响应发生了增强或者抑制的现象[11]，影响分析结果的准确性。考察4种化合物在豆芽中均为基质抑制效应.为提高目标化合物测定的准确度，本方法使用空白基质提取液配制标准曲线，降低基质干扰的影响。

2.5 方法的线性范围和检出限

将 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L 系列基质标准工作溶液分别进行测定。以质量浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，赤霉素、6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴在1.0 μg/L～200.0 μg/L的范围内，其浓度与各待测物的峰面积呈良好的线性关系。4种添加物的线性回归方程、相关系数、线性范围及检出限（信噪比S/N≥3）见表3。

表3 豆芽中4种添加物的线性回归方程、相关系数、线性范围及检出限Table 3 Linear equation，coefficient correlation，linear range，LODs of four additives in bean sprouts

2.6 方法的准确度和精密度

由宁夏食品检测中心自制3种不含目标化合物的豆芽（黄豆芽、绿豆芽、扁豆芽）作为空白样品进行加标回收率试验，添加水平分别为0.045、0.090、0.15 mg/kg进行测定，其中赤霉素的回收率范围为68.9%～115.2%；6-苄基腺嘌呤的回收率范围为68.1%～105.8%；4-氯苯氧乙酸的回收率范围为75.3%～119.0%、2，4-滴的回收率范围为63.8%～102.6%。其相对标准偏差范围为1.94%～12.34%，其精密度符合方法学的要求。赤霉素、6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴添加浓度及回收率的数据见表4。

表4 赤霉素、6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴的回收率及精密度试验Table 4 The recovery and precision experiment for four additives in bean sprouts

2.7 样品测定

本方法对市售豆芽进行测定。随机采购市售黄豆芽、绿豆芽、扁豆芽各10个批次，其中9个批次未检出，一个批次黄豆芽中检出4-氯苯氧乙酸。样品图谱见图3。

图3 黄豆芽样品色谱图Fig.3 MS/MS spectra for four additives in Soybean sprouts

3 结论

建立高效液相色谱-串联质谱法结合分散固相萃取技术，同时测定豆芽中赤霉素、6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴残留的分析方法。该方法前处理操作简单，净化效果好，灵敏度高，能够满足豆芽中4种药物残留的定性和定量分析。

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