不同沉水植物根际微域中菲和芘的降解行为

孟凡波，于田田，迟 杰，刘宏艳

(天津大学环境科学与工程学院，天津 300350)

多环芳烃(PAHs)是一类典型的持久性有机污染物[1]，在环境中普遍存在，具有慢性毒性和潜在的致畸、致癌和致突变的“三致”作用.美国环境保护局(U.S.EPA)早在 20世纪 80年代初就将其中的 16种列为优先控制污染物.PAHs通过废水排放、大气沉降等途径进入水体后，会强烈地分配到非水相并吸附在颗粒物上，进而沉降到底泥中，使沉积物成为其主要的环境归宿[2].

微生物降解是沉积物中PAHs去除的主要途径，而植物修复因能促进沉积物中微生物降解而成为一种绿色环保、具有发展前景的原位修复技术.沉水植物在水生态系统中具有非常重要的生态功能，它们可以吸收水体中的有害物质净化水质，为水体中的生物提供营养物质和栖息地，根系还可以固定底质防止再悬浮[3].常见的沉水植物有苦草、狐尾藻、黑藻和菹草等.不同沉水植物根系发达程度不同，对沉积物中PAHs降解的促进作用也不同.目前利用沉水植物修复沉积物中的 PAHs已初见成效[4]，但都基于盆栽实验，无法清楚阐述PAHs降解的根际效应.

笔者选取了两种沉水植物(苦草和狐尾藻)，利用自制的多隔层根箱，研究了不同沉水植物根际沉积物中菲和芘质量分数的梯度变化.同时还监测了氧化还原电位(Eh)、PAH-降解菌和磷脂脂肪酸(PLFAs).在此基础上，比较了两种沉水植物根际PAHs的降解并分析了氧对降解的影响.

1 材料与方法

1.1 实验材料

菲和芘，分析纯，纯度≥98%,，京东仁成工业株式会社生产；试剂均为分析纯，天津市化学试剂一厂生产.狐尾藻采自天津大学敬业湖，并采用 Zhou等[5]的组织培养方法进行培养和繁殖；苦草种子购买于江苏固城湖渔村店，然后进行幼苗培养.

沉积物采自天津海河干流表层沉积物(0～15,cm)，阴凉遮光处自然风干后过 2,mm 筛.采取先局部染毒，再全部混匀的方式进行染毒：将适当浓度菲和芘的丙酮混合溶液均匀加入到所需总量 1/6的沉积物中，缓慢搅拌均匀，待丙酮挥发后，用剩余的5/6未染毒的沉积物稀释，多次搅拌后过2,mm筛，最终制得沉积物中菲和芘的质量分数分别接近12.0,mg/kg和13.0,mg/kg.

1.2 实验设计

自制一个长 12,cm、宽 12,cm、高 10,cm 的根箱(见图 1)，从上到下为根际区(S0，高 6,cm)、近根际区(高1,cm，用粘有500 目尼龙网2,mm厚的插片进一步分为 5层，分别为 S1、S2、S3、S4和 S5)和非根际区(S6，高3,cm).根际室内先加入334,g未染毒沉积物，将苦草(26株)、狐尾藻(30株)分别种植于浸湿的沉积物中，再将根际室放入有 36,L曝气水的玻璃水族箱中培养 1个月以获取植物根垫.待植物根垫形成后，每个插片内放入 33.4,g染毒沉积物，铺平并用水浸湿，每 5个插片平放摞在一起，放在非根际室(装有 501,g染毒沉积物)上，再将植物根际室放在最上面，4周用插销装置固定，继续培养 30天.同时设置无植物对照组.运行期间，保持光照强度为(2,200±100)lx，光暗比 12,h：12,h，控制温度为(22±1)℃.

图1 根箱及插片结构示意Fig.1 Illustrative diagram of designed rhizobox and nylon mesh supported by back-up carriage

实验结束时，先测定根际微域的氧化还原电位值，再取出植物样品测量长度和鲜量及 PAHs含量.依次取下插片，分别采集各微域中的沉积物样品，取部分新鲜样品立即测定 PAH-降解菌，其余部分冷冻干燥24,h后研磨，待进一步测定其他指标.

1.3 实验方法

1.3.1 PAHs含量分析

沉积物中菲和芘的分析方法：称取 5.0,g冷冻干燥后过 80目筛的沉积物样品于两层普通滤纸中包好，置于60,mL的索氏提取器中，用45,mL二氯甲烷索氏提取24,h.然后将提取液转移到100,mL的K-D浓缩管中，旋转蒸发(水浴温度＜35,℃)至约 1,mL.再转移至自制的净化柱内(内径为 1,cm，从上到下依次为 1,cm高无水硫酸钠、7,cm高中性氧化铝和14,cm高硅胶；使用前依次用 20,mL甲醇、30,mL正己烷清洗并弃去润洗液)，用 25,mL体积比为 2∶3的二氯甲烷和正己烷混合溶液洗脱并收集洗脱液，氮吹浓缩至 1,mL.处理后的样品用 Agilent 6890N/5975C气质联用仪测定，分析前加入10,µL的内标物(1,000,mg/L的六甲基苯).升温程序为：初始温度 100,℃，以 20,℃/min升温至 280,℃，保持2,min.载气氦气，流量为 1.0,mL/min，不分流进样，进样1,µL.进样口和检测器温度均为250,℃，接口温度为280,℃，EI源70,eV.

1.3.2 氧化还原电位测定

沉积物中 Eh采用丹麦 Unisense公司发明的穿刺型微电极测定.取出根箱，将参比电极固定在根际室内，然后将根际室中间位置的土层挖开，露出插片中间的方孔(每个插片中央位置预先挖 1,cm×1,cm的方孔)，旋转粗调螺旋和微调螺旋，使 Eh电极下降，观察信号值.当出现信号突变时，即为零点，开始测定.测定深度2,cm，步径50,µm.

1.3.3 PAH-降解菌测定

制备灭菌的无机盐培养基[6]，冷却到 50,℃时，加入适量菲和芘的丙酮溶液使培养基中菲和芘的质量浓度均为50,mg/L，超声20,min后倾倒于灭菌培养皿中，凝固后倒置于 30,℃黑暗培养箱中培养 24,h.称取 1,g吸干水的新鲜沉积物于灭菌锥形瓶中，加9,mL无菌水和玻璃珠，150,r/min水平振荡 30,min，静置 30,min.将上清液配制成 10-2、10-3、10-43个稀释度的菌悬液.然后分别吸取 0.2,mL菌液，涂布接种于无菌培养皿中，倒置于 30,℃培养箱中培养 5,d后计数.最终结果换算为 CFU/g来表示沉积物中PAH-降解菌数量.

1.4 数据分析

数据统计都采用SPSS 20.0软件完成.对实验不同处理组之间进行单因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan方法，在 α＝0.05水平进行数据差异显著性检验；并对不同指标间进行 Pearson相关性分析，以α＝0.05水平进行数据相关性显著性检验.

2 结果与讨论

2.1 根际微域中PAHs的去除

实验结束时，不同处理组和不同根际微域中菲和芘的质量分数都有明显的降低(见表 1).在对照组中，S1微域中菲质量分数显著低于其他微域，而芘质量分数在整个微域中变化并不明显.有植物组中，随着距根系距离的增加，菲和芘的质量分数也随之增加.在S1和S2微域中，植物组微域中PAHs含量显著高于对照组(p＜0.05)；而在S3～S6微域并没有显著差异(p＞0.05)，这说明植物根系明显促进了距根系4,mm内PAHs的降解.

表1 根际微域中菲和芘的质量分数Tab.1 Mass fractions of phenanthrene and pyrene in the rhizosphere

相应地，如图 2所示，菲和芘在苦草组、狐尾藻组、对照组中的去除率分别为 35.0%,～84.3%,和31.0%,～74.6%,、33.8%,～80.6%,和 39.8%,～69.7%,、32.3%,～54.4%,和 33.3%,～47.2%,.随着距根系距离的增加，3个处理组中菲和芘的去除率随之降低，并且植物组和对照组不同根际微域中 PAHs去除率的大小顺序分别为 S1＞S2＞S3～S6和 S1＞S2～S6，这说明PAHs在近根际微域中的去除作用更大.这是因为 S1和 S2微域距离植物根垫最近，受植物根系释放的根系分泌物和氧气的影响最强烈.此外，在S1和 S2微域中，PAHs去除率在 3个处理组中的差异最显著(p＜0.05)，其大小顺序为苦草＞狐尾藻＞对照；与对照组相比，种植苦草和狐尾藻分别使 S1微域中菲的去除率增加了29.9%,和26.2%,，使芘的去除率增加了 27.4%,和 22.5%,；分别使 S2微域中菲的去除率增加了 17.9%,和 13.8%,，使芘的去除率增加了8.8%,和 10.8%,.可以看出：①苦草对根际沉积物中PAHs去除的促进作用大于狐尾藻，这是因为在相同时间内，苦草根系的生长能力大于狐尾藻[7]，苦草的根系比狐尾藻更发达，可为微生物提供更多的营养物质和氧气；②菲的去除率高于芘，这是因为低环PAHs更易被降解，这一结果与已有报道一致[8-9].而在S3-S6微域中，菲和芘的去除率在3个处理组中无显著差异(p＞0.05)，这说明苦草和狐尾藻根系对根际沉积物影响的最大距离均为4,mm.

图2 根际微域中菲和芘的去除率Fig.2 Dissipation ratios of phenanthrene and pyrene in the rhizosphere

植物组沉积物中PAHs主要通过两种途径去除：一是微生物降解，二是植物的吸收作用.实验结束时测得苦草和狐尾藻体内菲的质量分数分别为0.05,mg/kg和 0.07,mg/kg，芘的质量分数分别为0.06,mg/kg和 0.09,mg/kg.质量守恒结果得出植物体内PAHs的富集量仅占S1微域内PAHs去除总量的0.53%,～0.99%,.可见，植物吸收对PAHs去除的贡献作用很小，微生物降解才是沉积物中PAHs主要的去除途径.

2.2 根际微域中PAH-降解菌数量

如图 3所示，植物组中 PAH-降解菌数量随着距根系距离的增加先下降后保持稳定，在 S1微域内获得最大值，说明近根际微域降解菌数量高于远根际；而对照组中随距离的增加并没有明显变化(p＞0.05).其中，距根系4,mm(S1和S2)微域内，苦草组PAH-降解菌数量显著高于狐尾藻组(p＜0.05)，与PAHs去除率的趋势一致；距根系 6,mm(S1～S3)微域内，植物组 PAH-降解菌数量明显高于对照组(p＜0.05)，并且高出 86.9%～217.7%,(苦草)和 32.3%～98.4%(狐尾藻).由此说明，苦草和狐尾藻根际作用影响 PAH-降解菌数量主要在近根际，虽然苦草对降解菌数量的促进作用更大，但两种植物根系影响降解菌的距离范围均为 6,mm.此外，统计分析表明，PAH-降解菌数量与 PAHs去除率之间有很好的正相关性(菲：r＝0.791，n＝54，p＝0.003；芘：r＝0.743，n＝54，p＝0.025).

图3 根际微域中PAH-降解菌数量Fig.3 PAH-degrading bacterial populations in the rhizosphere

2.3 根际微域中氧化还原电位

O2是 PAHs好氧生物降解过程中必需的电子受体.沉积物中 Eh可以用来表征沉积物中的氧含量[6].Jouanneau等[10]发现在芦苇根系周围的明亮区域中Eh为正值，而暗色的沉积物中 Eh为负值，这说明芦苇根系可提高根际区域的 Eh值.本研究利用Unisense微电极原位测定了苦草和狐尾藻根际微域中距植物根系20,mm内的Eh梯度变化情况，如图4所示.随着距根系距离的增加，苦草根际中的 Eh先快速下降(0,mm(477.8,mV)～6,mm(179.2,mV))后缓慢降低(6,mm(179.2,mV)～20,mm(95.2,mV))；狐尾藻根际微域中先快速下降(0,mm(409.8,mV)～4,mm(168.0,mV))后保持稳定(4～20,mm，平均值为162.5,mV)；而对照组中的 Eh(平均值为 132.7,mV)随距根系距离的增加没有变化.在距根系6,mm距离内，苦草根际中的 Eh值显著高于对照组(高出50.6～328.8,mV)，而狐尾藻根际中的 Eh值只在4,mm 的距离内高于对照组(高出 29.0～255.8,mV).这说明苦草根系对沉积物中氧的影响范围为 6,mm，狐尾藻根系的影响范围仅为 4,mm.这更进一步说明了苦草根系的释氧能力大于狐尾藻，使得苦草根际中氧的扩散距离远大于狐尾藻.Pearson相关性分析表明，沉积物中的 Eh值与降解菌数量之间有很好的正相关关系(r＝0.899，n＝45，p＝0.000)，表明根系释氧增加了根际沉积物中的氧浓度，提高了降解菌的数量，进而促进了沉积物中PAHs的降解[11].

图4 根际微域中氧化还原电位Fig.4 Sediment redox potential in the rhizosphere

3 结 论

(1)沉积物中 PAHs去除率沿着远离根系的方向呈下降趋势，苦草和狐尾藻明显提高了距植物根系4,mm 距离内菲(增幅分别为 17.9%～29.9%和13.8%～26.2%)和芘(8.8%～27.4%和 10.8%～22.5%)的去除率.说明苦草的根际效应大于狐尾藻.

(2)近根际(0～6,mm)微域，植物组 PAH-降解菌数量显著高于对照组，并且苦草组 PAH-降解菌数量显著高于狐尾藻组，统计结果也表明 PAH-降解菌数量和PAHs的去除率呈显著正相关.

(3)沉积物 Eh随着与根系距离的增大逐渐减小.苦草根系对沉积物中氧的影响范围为 6,mm，狐尾藻根系的影响范围仅为 4,mm，说明苦草的释氧能力大于狐尾藻.沉积物中的 Eh值与降解菌数量之间有很好的正相关性，说明高氧含量能增加 PAH-降解菌数量，进而促进PAHs的降解.

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