一种利用体外转录制备dsRNA的方法介绍*

刘海涛 舒端阳

（1 淮南师范学院生物工程学院 安徽淮南 232038 2 广东省梅州市丰顺中学 广东梅州 514300）

RNAi（RNA interference）是由dsRNA（double strand RNA）在细胞内被切割成siRNA（small interference RNA），从而引起的同源mRNA 特异性降解，针对性地关闭某个基因的表达，为人们研究具体某个基因的功能打开一扇窗户，所以被广泛用于生物学、医学等众多领域。然而要对某个基因进行有效的沉默需要制备与此基因mRNA 同源的dsRNA，怎样才能获得此dsRNA？ 目前应用比较广泛的方法有化学合成法、体外转录法、构建载体体内转录法等，本实验通过构建一个双启动子的表达载体，再体外转录制备dsRNA。

本实验以鳞翅目昆虫细胞色素c 基因片段为靶基因制备dsRNA，细胞色素c（cytochrome c，cyt c）是呼吸链中一种重要的蛋白质，正常细胞在受到凋亡因子（例如紫外线）刺激时cyt c 就会从线粒体中释放，激活caspase 家族蛋白酶，引起一系列的通讯级联，最终导致细胞凋亡。若将一个正常细胞的cyt c 的表达抑制后，用紫外线处理细胞还会发生凋亡，或者凋亡程度会不会减弱？这时即可用RNAi技术沉默cyt c 基因的表达。本实验以鳞翅目昆虫斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的离体细胞株Sl-1 为研究材料［1］，制备其cyt c 基因的一段dsRNA。

1 实验材料

PBS缓冲液、Sl-1细胞株、提取总RNA 的Tri-zol 试剂盒、逆转录酶M-MLV、DNA 连接酶、限制酶BamH I 和EcoR I、Taq 酶、RNA聚合酶、PCR 仪、带有T7 双启动子的质粒Litmus28i（图1）、微量移液器、EP 管、培养皿、4 种核糖核苷酸（NTP）、4 种脱氧核苷酸（dNTP）、冷冻离心机、焦炭酸二乙酯（DEPC）。

2 实验方法

2.1 提取总RNA［2］

1）取1 瓶对数期细胞（细胞数量约1.5×106个），用PBS 洗涤后加入1 mL TRIzol；室温静置5 min 后移入1.5 mL 离心管中。

2）加入0.2 mL 氯仿，轻微振荡15 s，冰上静置2 min。

3）12000g/15 min，4℃离心后取上层水相，保留中间相和有机相（其中含有DNA 和蛋白质）。

4）加入0.5 mL 异丙醇，轻轻混匀，冰上静置10 min。

5）12000g/10 min，4℃离心，弃上清液。

6）加入1 mL 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀；7 500 g/5 min，4℃离心后弃上清液。

7）加入50 μL DEPC处理过的超纯水溶解沉淀后取10 μL 用于琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示所提取RNA样品中28S rRNA 亮度约为18S rRNA的2 倍，说明RNA 质量较好（如图2所示）。

2.2 体外转录载体的构建

1）用微量移液器取5 μL 总RNA 为模板，加入1 μL M-MLV 逆转录酶、1 mg dNTP，16℃条件下对总RNA 进行逆转录，制备cDNA。

2）以cDNA 为模板，设计cyt c 基因片段（长度为248 bp）的引物：

上游5′-GAATTCTGCCACACTGTTGAAGCCGGT3′

下游5′-GGATCCGATCTGCACGCTCGTTTGCCT3′

引物两头分别加上EcoR I 和BamH I 的酶切位点，PCR 反应（图3）。

3）PCR 产物测序正确后，电泳切胶回收。

4）37℃条件下加入EcoRⅠ和BamH Ⅰ对纯化后的片段和质粒Litmus28i 同时进行酶切反应3 h。

5）分别将双酶切后的片段和质粒纯化后进行连接反应，4℃，10h 得到重组DNA 分子（图4）。

6）为保证重组DNA 分子插入正确，用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ同时进行双酶切验证，电泳检测插入正确（图5）。

2.3 体外转录

1）将重组DNA 分子分为2 份，分别用BamHⅠ和EcoR Ⅰ进行酶切，作为体外转录模板（图6）。

2）加入1 μL RNA 聚合酶、NTP 2 mg 及缓冲液，37℃水浴使转录持续进行4 h 后，65℃加热变性5 min 后迅速冰浴使2 种互补的单链RNA 退火形成dsRNA，电泳检测（图7）。

此时的dsRNA 序列与斜纹夜蛾cyt c 基因的一段是完全同源的，可以利用脂质体转染Sl-1 细胞，进行RNAi 的相关实验。

3 讨论及意义

体外转录实验能否成功主要取决于的限制酶选择，只有选择切口为5′-突出末端（5′-overhang）或平末端（blunt-end）限制酶才能成功进行体外转录，本实验选用的限制酶EcoR I 和BamH I 都属于5′-突出末端；若所采用的限制酶（如Pst I）切出的切口为3′-突出末端（3′-overhang），则RNA聚合酶在体外转录结束后无法与模板脱离，导致转录失败。

RNA 干扰现象广泛存在于多种生物，有效地组织外源病毒的侵染、参与机体发育、调节基因的表达等，因此研究RNAi 具有重要的意义。然而研究RNAi 的前提就是如何高效地制备相应的dsRNA。

最初研究人员是通过化学合成的方法直接合成siRNA 用于实验，这种方法最为简单，客户只要知道相应目的基因的碱基序列，生物公司就会根据其要求提供高质量的siRNA，不过价格十分昂贵，且需要在靶基因中事先筛选出一段最有效的序列再进行化学合成，因此定制周期较长。

2002年，Novina CD 等［3］开发出一种利用腺病毒感染的方法将靶基因带入受体细胞，达到了较高的转染率且能持续稳定地在细胞内转录出siRNA，因此利用病毒载体是目前唯一一种可以长期研究RNAi 的方法，而且相比于化学合成这种方法的成本低。但是病毒载体只能转染原代培养的哺乳动物细胞，对于果蝇、线虫和斑马鱼这类生物则无能为力。

然而，通过构建表达载体在体外进行转录合成dsRNA 的费用相比于化学合成法要低得多，也能较快地得到dsRNA。一旦得到靶基因的模板序列，只要48 h 就可以RNAi 实验，通常一次体外转录得到的dsRNA 可以进行上百次的RNAi 实验。利用脂质体可以将dsRNA 导入受体细胞，虽然转染效率略低于病毒载体，但是脂质体包裹着这些siRNA 可以与哺乳动物、线虫、鱼类、果蝇和各种植物的细胞发生融合，因此体外转录是目前进行RNAi 最有效的手段。