HPLC法测定克白酊中补骨脂素、异补骨脂素和盐酸异丙嗪的含量＊

高 媛，孙 旭，刘云云，马晓昱，程艳芹，陈 瑶

白癜风是一种常见的后天性局限性或泛发性皮肤色素脱失病，由于皮肤的黑素细胞功能消失引起，机制尚不清楚。海军官兵急性和长期暴露于太阳光，阳光中超强的紫外线所致光毒性反应、光变态反应，皮肤中产生大量的自由基，如单线态氧、过氧化氢和氮等，使黑色素细胞受损或转运发生障碍，可致白癜风的发生率增高。药物治疗有激素类、免疫调节剂、大剂量维生素等，但效果多不佳。克白酊是解放军第401医院研制，以补骨脂为主药，红花、荆芥、盐酸异丙嗪等组成的复方制剂，具有温经活血，软坚透络的作用，用于治疗白癜风并取得良好的治疗效果。为了进一步完善该品种的质量标准，该研究建立HPLC测定克白酊中补骨脂素、异补骨脂素［1］和盐酸异丙嗪［2］含量的方法，操作简单，结果准确，重现性好，能有效控制该制剂质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ZF-6型三用紫外分析仪；METTLER AE240电子天平；岛津LC-20AT高效液相色谱仪；AS-B超声波清洗仪；HG-B电热恒温干燥箱。

1.2 试药 甲醇为色谱纯；对照品补骨脂素（批号110739-201115，中国食品药品检定所，纯度：99．3%）、异补骨脂素（批号110738-201313，中国食品药品检定所，纯度：100．0%）、盐酸异丙嗪（批号 100422-201002，中国食品药品检定所，纯度：99．4%）；克白酊（批号 20140910、20140911、20140912）。

2 方法与结果

2.1 补骨脂素和异补骨脂素的含量测定［1，3］

2.1.1 色谱条件及系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（52∶48）为流动相；检测波长为246 nm，柱温为25℃；流速1.0 ml/min；补骨脂素峰保留时间为5.926 min，分离度为1.749，理论板数为3026；异补骨脂素峰保留时间为7.965 min，分离度为2.043，理论板数为3595。阴性对照、对照品以及供试品的HPLC色谱图见图1A，1B，1C和 1D。

图1 阴性对照、对照品以及供试品的HPLC色谱图

2.1.2 对照品溶液的制备 分别取补骨脂素和异补骨脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含补骨脂素1.819 mg的对照品溶液和每1 ml含异补骨脂素1.704 mg的对照品溶液（对照品储备液），精密量取适量于容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得40 μg/ml的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密量取克白酊20 ml，蒸干，残渣加入甲醇50 ml，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25 ml置于50 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 阴性对照品溶液的制备 取缺补骨脂的样品，按“2.1.3”项下方法制备成阴性对照品溶液。

2.1.5 标准曲线的绘制 分别取“2.1.2”项下补骨脂素、异补骨脂素对照品储备液适量，以甲醇为溶剂稀释，得系列标准溶液。含补骨脂素和异补骨脂素为 10、20、40、80、100 μg/ml，分别取 20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积值为纵坐标（Y），浓度（μg/ml）为横坐标（X）绘制标准曲线。计算得补骨脂素回归方程：Y=16525X+29868，R2=0.9999；异补骨脂素回归方程：Y=15873X+44765，R2=1，实验表明补骨脂素和异补骨脂素在10～100 μg/ml的范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.1.6 精密度试验 分别精密吸取 “2.1.5”项下40 μg/ml补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液20 μl，按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积值，计算RSD分别为0.13%和0.10%。说明仪器的精密度良好。

2.1.7 重现性试验 取克白酊（批号20140912），按“2.1.3”项下方法分别制备6份供试品溶液，分别进样20 μl，记录补骨脂素和异补骨脂素峰面积值，计算RSD（n=6）分别为0.80%和1.76%，表明方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 取克白酊（批号20140912），按“2.1.3”项下方法配制供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12 h 进样 20 μl，按“2.1.1”项下色谱条件，测定补骨脂素、异补骨脂素的峰面积，计算RSD分别为2.11%和2.40%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.9 加样回收率试验 取已知含量的克白酊样品（批号20140912）12份，在线性范周内分别加入一定量的补骨脂素、异补骨脂素对照品溶液各6份，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果详见表1、表2。说明本方法回收率良好。

2.1.10 样品含量测定 按“2.1.1”项下色谱条件，分别精密吸取“2.1.2”“2.1.3”项下溶液各 20 μl，按照 2015 年版《中国药典》四部 0512［3］），进样 3 批克白酊样品（批号 20140910、20140911、20140912），每批样品测定3份，以外标法计算各个样品中补骨脂素和异补骨脂素的含量，结果详见表3。

2.2 盐酸异丙嗪的含量测定［2，3］

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（用冰醋酸调节pH 至 2.3）（45∶55）为流动相；检测波长为 254 nm，柱温为25℃；流速1．0 ml/min；盐酸异丙嗪峰保留时间为 9．918 min， 分离度为 1．544， 理论板数为2223。阴性对照、对照品以及供试品的HPLC色谱图见2A，2B和2C。

表1 补骨脂素加样回收率试验测定结果

表2 异补骨脂素加样回收率试验测定结果

表3 克白酊样品中补骨脂素和异补骨脂素含量（mg/100 ml）测定结果（n=2）

图2 阴性对照、对照品以及供试品的HPLC色谱图

2.2.2 对照品溶液的制备 取盐酸异丙嗪对照品适量，精密称定，加0．1 mol/L盐酸溶液制成每1 ml含盐酸异丙嗪1．056 mg（对照品储备液），精密量取适量于容量瓶中，加0．1 mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得20 μg/ml的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取克白酊40 ml，蒸干，残渣加入0．1 mol/L盐酸溶液50 ml，称定重量，超声处理 30 min，放冷，再称定重量，用 0．1 mol/L盐酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液10 ml置100 ml量瓶中，用0．1 mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 阴性对照品溶液的制备 取缺制盐酸异丙嗪的样品，按“2．2．3”项下方法制备成阴性对照品溶液。

2.2.5 标准曲线的绘制 取“2．2．2”项下盐酸异丙嗪对照品储备液适量，以0．1 mol/L盐酸为溶剂稀释，得系列标准溶液。含盐酸异丙嗪为10、20、40、60、80 μg/ml，分别取 20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。 以峰面积值为纵坐标（Y），浓度（μg/ml）为横坐标 （X）绘制标准曲线。计算得回归方程，Y=94716X-13730，R2=0．9994。 实验表明盐酸异丙嗪在10～80 μg/ml的范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取“2．2．5”项下 20μg/ml盐酸异丙嗪对照品溶液 20 μl，按“2．2．1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积值，计算RSD为1．04%。说明仪器的精密度良好。

2.2.7 重现性试验 取克白酊（批号20140912），按“2．2．3”项下方法分别制备 6 份供试品溶液，分别进样20 μl，记录盐酸异丙嗪峰面积值，计算 RSD（n=6）为 1．52%，表明方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 取克白酊（批号20140912），按“2．2．3”项下方法配制供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8，12 h 进样 20 μl，按“2．2．1”项下色谱条件，测定盐酸异丙嗪的峰面积，计算RSD为2．82%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的克白酊样品（批号20140912）6份，在线性范周内分别加入一定量的盐酸异丙嗪对照品溶液，按“2．2．1”项下色谱条件测定，结果详见表4。回收率良好。

表4 盐酸异丙嗪加样回收率试验测定结果

2.2.10 样品含量测定 按“2．2．1”项下色谱条件，分别精密吸取 “2．2．2”“2．2．3” 项下溶液各 20μl，照2015 年版《中国药典》四部 0512［3］），进样 3 批克白酊样品（批号 20140910、20140911、20140912），每批样品测定3份，以外标法计算各个样品中盐酸异丙嗪的含量，结果详见表5。

表5 克白酊样品中盐酸异丙嗪含量（mg/100 ml）测定结果（n=2）

3 讨论

克白酊是由补骨脂为主药，红花、荆芥和盐酸异丙嗪等组成的复方制剂，《中国药典》记载其外用可以消风祛斑。该制剂在中药之中添加了少量化学药盐酸异丙嗪，盐酸异丙嗪为H1受体拮抗药，具有抗过敏和镇静作用。因此，笔者采用HPLC法对方中补骨脂主要活性成分补骨脂素和异补骨脂素［1，3-5］以及盐酸异丙嗪［2，3，6，7］的含量进行测定。补骨脂素和异补骨脂素在246 nm波长有最大吸收，因此该波长作为其检测波长；用流动相稀释盐酸异丙嗪后进行紫外扫描，其最大吸收在254 nm，故选择254 nm为盐酸异丙嗪含量测定的检测波长。实验表明，在分别设定的色谱条件下，克白酊中的补骨脂素、异补骨脂素和盐酸异丙嗪与相邻色谱峰能有效分离，样品含量稳定。

该方法操作简单，专属性强，重现性较好，结果准确等优点，可作为克白酊的质量标准，控制本品的质量。

参考文献

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［S］．2015年版．北京：中国医药科技出版社，2015：187．

［2］国家药典委员会．中华人民共和国药典（二部）［S］．2015年版．北京：中国医药科技出版社，2015：969．

［3］国家药典委员会．中华人民共和国药典（四部）［S］．2015年版．北京：中国医药科技出版社，2015：59-61．

［4］付前霞．益肾灵颗粒中补骨脂含量测定的研究［J］．临床合理用药，2011，10（4B）：100-101．

［5］张婷，龚志成，唐芬芬．补骨脂微乳液中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定［J］．医药导报，2012，31（12）：1619-1621．

［6］陈晓峰，张卫．HPLC测定消炎止痛醑中盐酸异丙嗪的含量［J］．北方药学，2012，9（8）：2-3．

［7］蔡涛．HPLC法同时测定氨酚异丙嗪注射液种对乙酰氨基酚与盐酸异丙嗪的含量［J］．中国药品标准，2012，13（6）：441-461．