中国米虾bursicon基因的功能及作用机制

任丽琦 翁洁羊 王 鑫 孙金生 李 冉

(天津师范大学生命科学学院， 天津市动植物抗性重点实验室， 天津 300387)

节肢动物的体表有坚硬的外骨骼， 包括基膜、表皮细胞层和角质层三部分。外骨骼有保护内部器官， 维持身体形态， 防止体内水分蒸发， 抵抗化学或机械损伤， 阻挡病原微生物入侵等作用[1]。这类坚硬的外壳在虾、蟹、昆虫等中比较常见。由于外骨骼对节肢动物生长的限制作用， 所以旧表皮必须间歇式的蜕去并不断产生新表皮。动物刚形成的表皮较为柔软， 适应生长， 但是容易感染病原微生物或者受到外界损伤， 因此新形成的表皮需要迅速地进行鞣化。

1962年Fraenkel、Hsiao和Cottrell将刚羽化的红头丽蝇(Calliphora erythrocephala)颈部进行结扎，结果其胸部和腹部的表皮没有发生骨化现象， 之后又向这些红头丽蝇体内注射了正常发育的同种个体的血淋巴， 发现胸部、腹部的表皮开始快速发生骨化[2，3]。所以Fraenkel和Hsiao认为在血淋巴中很可能有一种物质， 调控红头丽蝇刚刚羽化后新产生的表皮发生鞣化， 并将其命名为鞣化激素(Bursicon)[4]。此后的40多年里， 尽管有许多关于鞣化激素生理活性的文章陆续发表， 但是一直不能成功分离和纯化该激素， 其分子生理学性质也不能确定， 鞣化激素的研究一直没有突破性的进展。伴随高通量测序技术日渐成熟和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)基因组全序列的公布[5]， Dewey等研究表明在黑腹果蝇中CG13419基因编码鞣化激素BURS亚基，并且证实鞣化激素除了可以使分泌形成的新表皮迅速鞣化外， 还与翅的伸展有关[6]。Bhat等研究证明鞣化激素在许多昆虫中的分子量都大约为30 kD[7]，Honegger等也发现黑腹果蝇中的CG13419基因编码鞣化激素但是其编码的分泌蛋白仅有15 kD[8]。之后Luo和Mendive等发现在黑腹果蝇中鞣化激素是一种由2个胱氨酸结蛋白构成的异源二聚体， 2个亚基分别是BURS (α)和PBURS (β)。其中PBURS(β)亚基由CG15284基因编码， 所编码的分泌蛋白也是15 kD。将CG13419和GG15284在细胞中一起转染， 两者共同表达的蛋白才可以促使颈部结扎的红头丽蝇的表皮发生骨化[9，10]。

Baker和Truman认为[11]， DLGR2是黑腹果蝇鞣化激素的受体， 该受体是一种G蛋白偶联受体并由rickets基因编码。鞣化激素具体作用机制被认为是Bursicon先和LGR2受体结合， 导致第二信使的环腺苷酸(cAMP)大量生成[10]， 进一步使下游蛋白激酶A(PKA)被激活， 促进酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase)的磷酸化[12]， 酪氨酸(Tyrosine)在活化的酪氨酸羟化酶的催化下转变成多巴(DOPA)， 最后使表皮发生鞣化； 而且鞣化激素可以经cAMP/PKA通路调控翅的成熟、伸展[13]； BURS或PBURS两个亚基还可以分别形成同源二聚体， 通过IMD通路， 使转录因子Relish激活， 进而参与昆虫的免疫过程[14]。

在节肢动物的昆虫纲[15—18]、甲壳纲[19—23]、蛛形纲[15]甚至是棘皮动物的紫海胆[16]中都发现了鞣化激素， 特别是在昆虫纲中研究的比较多。在甲壳纲中如普通滨蟹(Carcinus maenas)[19，20]、蓝蟹(Callinectes sapidus)[21]、欧洲龙虾(Homarus gammarus)[22]、斑节对虾(Penaeus monodon)[23]中也发现了鞣化激素的存在， 对该激素合成和释放部位以及在发育过程和蜕皮周期中的表达模式进行了鉴定， 尤其是在蓝蟹中的研究表明鞣化激素的重组蛋白可以促进其新表皮角质层的增厚。目前鞣化激素在米虾中尚未有报道。米虾属于甲壳纲(Crustacea)、匙指虾科(Atyidae)， 包括如多齿新米虾(Neocaridina denticulate)、弯额米虾(Caridina curvifrons)、浙江米虾(Caridina zhejiangensis)等。因为米虾具有个体偏小， 生长迅速， 易存活， 繁殖周期短等特点，适合作为生理、生态等实验研究的材料。

本研究以米虾为实验对象， 首次克隆了米虾鞣化激素α和β两个亚基基因的开放阅读框片段， 利用实时荧光定量PCR测定了米虾蜕皮周期中两个亚基基因的表达特征。利用RNA干扰技术分析鞣化激素功能， 为进一步研究鞣化激素在米虾生长发育过程中的生理功能提供了基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用的中国米虾购买于浙江， 体长约1.5—2.5 cm， 健康有活力， 米虾购买回后养在实验室中， 水箱大小为15 cm×20 cm×15 cm， 曝气， 温度为26—28℃， 每天投喂虾粮， 1周更换3次水。

1.2 米虾总RNA提取和反转录

按TRIzol®Reagent (Thermo Fisher Scientific)试剂使用说明提取米虾总RNA， 超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific)和1%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和完整性。以总RNA为模板， 参考反转录试剂盒(TransScript®one-step gDNA Remover and cDNA Synthesis SuperMix， 北京全式金生物)说明书， 反转录获得cDNA第一条链， 使用内参基因βactin引物(β-actin F、β-actin R， 表 1)通过PCR对cDNA模板进行检测。

1.3 米虾鞣化激素基因bursicon-α和bursicon-β序列的克隆

用软件Primer 5.0设计bursicon-α和bursiconβ的ORF区的引物(bursicon-α F、bursicon-α R、bursicon-β F、bursicon-β R， 表 1)， 参考ExTaq酶(TakaRa)的使用说明书， 以米虾cDNA为模板PCR扩增目的基因bursicon-α和bursicon-β的ORF区。bursicon-α反应程序为94℃预变性4min； 94℃变性30s， 55℃退火30s， 72℃延伸1min， 35个循环；72℃延伸10min。bursicon-β反应程序的退火温度为60℃， 其余与bursicon-α反应程序相同。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后， 扩大体系， 参照使用说明书， 用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)将目的片段切胶回收纯化， 连接到pMDTM18-T Vector (Takara)上， 并将菌液送至金唯智生物科技有限公司完成测序。

1.4 bursicon生物信息学分析

用DNAStar (version7.1)软件分析bursicon-α和bursicon-β基因序列和氨基酸序列。利用蛋白组学在线ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化性质， 用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白的结构域， 用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)检测蛋白是否有信号肽。将bursicon-α和bursicon-β的ORF区在NCBI (National Center for Biotechnology Information)的GenBank数据库中进行BLASTx比对， 鉴定所编码的蛋白质并且找出多个同源序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)， 同源序列在BioEdit软件中进行比对后用MEGA 5.2软件中的NJ法(Neighborjoining)进行系统树构建。

表 1 本研究所用的引物序列Tab. 1 Primers used in the study

1.5 鞣化激素基因bursicon在不同蜕皮周期的表达特征分析

根据康现江等[24]对中华锯齿米虾蜕皮周期的分类方法， 可将米虾的蜕皮周期分为4个时期: 蜕皮后期(A-B期)、蜕皮间期(C期)、蜕皮前期(D期)和蜕皮期(E期)。其中D期可进一步分为D0-1、D2、D3、D44个亚期。参考TRIzol使用说明书提取米虾不同蜕皮时期胸腹神经节中的RNA并进行反转。使用实时荧光定量PCR仪FAST7500(ABI)， 以AB期、C期、D0-1期、D2期、D3期、D4期、E期共7个时期的cDNA为模板分别检测bursicon-α和bursicon-β在不同蜕皮时期的相对表达量。根据获得的bursicon-α和bursicon-β的ORF区的基因序列用Primer 5.0设计特异性引物(bursicon-α QPCR F、bursicon-α QPCR R、bursicon-β QPCR F、bursiconβ QPCR R， 表 1)。以β-actin为内参基因。参考Fast-Star Universal SYBR Green Master (Rox)说明书进行Real-time PCR反应。每组样品设3个平行， 按2–△△Ct法对得到的数值进行统计计算后， 用SPSS17.0软件分析各时期bursicon-α和bursicon-β相对表达量的显著性差异， 并用Origin 8.0作图。

1.6 RNA干扰

设计bursicon-α和bursicon-β双链RNA片段的特异性引物(dsbursα F、dsbursα R、dsbursβ F、dsbursβ R， 表 1)， 利用HT115菌株来制备目的基因的双链RNA片段bursicon-αdsRNA (dsburs α)和bursicon-βdsRNA (dsburs β)， 以GFPdsRNA(dsGFP)为对照。将米虾分为3组， 用显微注射器分别向每组米虾中注射合成的dsRNA (dsGFP组、dsburs α组、dsburs β组)， 每只虾注射1 μg。第2、第6天分别取样， 提取总RNA， 经反转录、实时荧光定量PCR对干涉效果进行检测。选取处于蜕皮周期D0-1期同等大小的米虾， 分为4个组， 分别注射dsGFP、dsburs α、dsburs β、dsburs α与dsburs β质量浓度比为1∶1的混合液。注射总量为1 μg/只，48h后每组虾剪其尾扇并在显微镜下观察所处的蜕皮时期， 记录每组虾从蜕皮后期D0-1期到蜕皮期E期的时间。

1.7 组织学观察

同样以蜕皮周期处于D0-1期的米虾为实验对象， 分为4组分别注射dsRNA (同上)。当米虾蜕皮周期处于D3期时， 在旧的外骨骼下生成了新的外骨骼。每组处理组用解剖剪和镊子将其头胸部背部旧的外骨骼小心剥离后分别取其新的外骨骼并固定在4%的多聚甲醛中， 石蜡包埋后切片并用甲苯胺蓝染色， 最后用光学显微镜观察、拍照。

2 结果

2.1 bursicon-α和bursicon-β基因的克隆与序列分析

米虾bursicon-α基因开放阅读框(ORF)为441 bp，编码146个氨基酸， 翻译的蛋白理论等电点为5.67，预测分子量为15993.65 Da， 氨基酸序列的1—26位是信号肽(GenBank登录号: MG766223)。经保守结构域预测bursicon-α基因翻译形成的氨基酸序列具有一个C末端胱氨酸结节状结构域(CTCK)， 长度为89个氨基酸， 位于氨基酸序列的第31至第119位并且该结构域与二聚体的形成有关。此外α亚基含有11个半胱氨酸残基。bursicon-β基因开放阅读框(ORF)为411 bp， 编码136个氨基酸， 翻译的蛋白理论等电点为6.07， 预测分子量为15145.19 Da， 氨基酸序列的1—21位是信号肽(GenBank登录号为MG766224)。bursicon-β基因翻译形成的氨基酸序列同样含有一个C末端胱氨酸结节状结构域(CTCK)， 长度为103个氨基酸， 位于氨基酸序列的第30至第132位。此外β亚基中也含有11个半胱氨酸残基。

2.2 米虾中鞣化激素Bursicon同源性分析及系统进化树构建

利用BioEdit软件， 将米虾和其他甲壳纲、昆虫纲中13种物种中鞣化激素α亚基的氨基酸序列进行了比对后采用MEGA5.2软件中的NJ法构建系统进化树(图 1)。结果表明米虾α亚基与甲壳纲十足目的α亚基序列亲缘关系较近， 包括斑节对虾、蓝蟹、普通滨蟹、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)。同时BLAST分析表明米虾α亚基与斑节对虾的同源性高达89%， 亲缘关系最近。

同上述方法相同， 采用MEGA5.2软件中的NJ法构建β亚基系统进化树(图 2)。结果表明米虾β亚基和甲壳纲十足目的斑节对虾、欧洲龙虾亲缘关系较近。同时BLAST分析表明米虾β亚基与斑节对虾的同源性高达77%， 亲缘关系最近。

2.3 鞣化激素在米虾蜕皮周期中的表达特征分析

图 1 米虾和其他物种Bursicon-α亚基系统进化树Fig. 1 Phylogenic tree of bursicon-α subunit in Caridina and other species

利用实时荧光定量PCR检测了蜕皮周期中bursicon-α和bursicon-β的相对表达量(图 3)， 结果发现米虾胸腹神经节中bursicon-α和bursicon-β在蜕皮周期不同阶段的相对表达量存在差异。α和β两个亚基的表达趋势相似， 在蜕皮后期(D期)相对表达量开始上升， 到蜕皮后期D3期时相对表达量最高，之后相对表达量开始下调， 在蜕皮期E期相对表达量最低。

图 2 米虾和其他物种Bursicon-β亚基系统进化树Fig. 2 Phylogenic tree of bursicon-β subunit in Caridina and other species

图 3 米虾bursicon-α和bursicon-β在不同蜕皮阶段的相对表达量Fig. 3 Relative expression levels of bursicon-α and bursicon-β in Caridina under different molt stages

2.4 RNA干扰沉默鞣化激素基因对米虾表型的影响

dsRNA干扰后bursicon基因的表达特征分析

为了研究鞣化激素基因对米虾蜕皮发挥的作用， 我们采用肌肉注射， 分别将dsburs α和dsburs β注射到实验组的米虾体内， 之后利用实时荧光定量PCR检测干扰效果(图 4)。实验表明， 在干扰48h后， 实验组中(注射dsburs α、dsburs β)bursiconα和bursicon-β的相对表达量与对照组(注射dsGFP)相比显著下降， 表明dsRNA的干扰效果明显。

dsRNA干扰后对蜕皮过程的影响本研究选取处于蜕皮前期D0-1的米虾作为实验对象， 注射dsRNA 48h后， 剪取米虾的尾扇并在显微镜下观察。结果表明在注射dsRNA2d后， 对照组即注射dsGFP的米虾的蜕皮时期向前推进到了蜕皮前期D3期(premolt， D3stage)； 然而分别向米虾中注射了dsburs α、dsburs β、dsburs α和dsburs β质量浓度比为1∶1混合液的三组实验组蜕皮时期仅向前推进到了蜕皮前期D2期(premolt， D2stage)(图 5)。与对照组相比， 实验组的蜕皮过程出现了延迟。

对4组米虾蜕皮时间进行统计， 分别记录从蜕皮前期(D0-1stage)到蜕皮期(E stage)的时间(图 6)。结果表明注射dsGFP的对照组蜕皮时间平均为59.9h， 注射dsburs α的实验组蜕皮时间平均为89.6h，注射dsburs β的实验组蜕皮时间平均为89.9h， 按质量浓度比为1∶1注射dsburs α和dsburs β混合液的实验组蜕皮时间平均为91.7h。比较4组米虾蜕皮时间发现， 与对照组相比， 3组实验组从蜕皮前期(D0-1stage)到蜕皮期(E stage)的时间明显增加。

dsRNA干扰后对米虾甲壳角质层厚度和硬度的影响选取处于蜕皮前期D0-1期的米虾注射dsRNA， 当其处于蜕皮前期D3期时， 将新形成的外骨骼剥离并制作石蜡切片(图 7A)并对双链干扰前后米虾的角质层厚度做统计学分析(图 7B)。结果显示， 对照组中(注射dsGFP)米虾角质层厚度为(3.57±0.18) μm， 注射dsburs α的实验组中米虾角质层厚度为(1.13±0.12) μm， 注射dsburs β的实验组中米虾角质层厚度为(1.04±0.15) μm， 注射dsburs α和dsburs β质量浓度比为1∶1混合液的实验组中米虾角质层的厚度为(1.02±0.14) μm。与对照组相比，3组实验组注射dsRNA后形成新表皮中角质层厚度变薄。

3 讨论

鞣化激素属于神经激素。它与昆虫及甲壳动物等体壁的骨化(黑化和硬化)有关， 甚至影响昆虫翅的伸展。以模式昆虫果蝇为研究对象发现， 鞣化激素由Bursicon-α (BUR)和Bursicon-β (PBURS)两个胱氨酸结蛋白亚基构成[9，10]。目前已经在许多不同种昆虫及甲壳动物中对鞣化激素基因有了一定的研究。

图 4 RNA干扰后bursicon-α和bursicon-β相对表达量随时间的变化Fig. 4 The relative expressions of bursicon-α and bursicon-β change over time after interfering the dsRNA

图 5 dsRNA干扰对米虾蜕皮过程的影响Fig. 5 Effect of dsRNA interference during molting process of Caridina

图 6 dsRNA干扰对米虾蜕皮时间的影响Fig. 6 Effect of dsRNA interference on ecdysis time of Caridina

本文首次克隆获得了米虾鞣化激素两个亚基基因的ORF区序列。bursicon-α基因ORF区长441 bp，编码146个氨基酸；bursicon-β基因ORF区长411 bp，编码136个氨基酸。序列分析表明， 米虾中克隆得到的鞣化激素与其他甲壳纲和昆虫纲中的物种有较高的序列一致性， 说明克隆得到的基因的确是鞣化激素基因(图 1、图 2)。Blast比对米虾鞣化激素α亚基与其他13种物种的α亚基序列发现， 米虾与蓝蟹、普通滨蟹、克氏原螯虾、斑节对虾、水蚤(Daphnia arenata)、大型溞(Daphnia magna)六种甲壳纲物种有68%—89%的相似性； 与烟草天蛾(Manduca sexta)、家蚕(Bombyx mori)、西方蜜蜂(Apis mellifera)、德国小蠊(Blattella germanica)温带臭虫(Cimex lectularius)、黑腹果蝇、家蝇(Musca domestica)七种昆虫有58%到70%的相似度。其中米虾和斑节对虾的同源性最高(89%)， 和家蚕同源性最低(58%)。同样Blast比对米虾β亚基与其他13种物种的β亚基序列发现， 米虾与斑节对虾、欧洲龙虾、普通滨蟹、蓝蟹、水蚤、大型溞六种甲壳纲物种有58%到77%的相似度。与烟草天蛾、家蚕、西方蜜蜂、中欧山松大小蠹(Dendroctonus ponderosae)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、黑腹果蝇、家蝇七种昆虫有47%到54%的相似度。其中米虾和斑节对虾的同源性最高(77%)， 和家蚕、家蝇同源性最低(47%)。进一步结构域分析发现米虾鞣化激素两个亚基的氨基酸序列都比较保守。

图 7 由dsRNA介导的bursicon-α和bursicon-β敲降对米虾角质层形成和鞣化的影响Fig. 7 The bursicon-α and bursicon-β knockdown mediated by dsRNA impairs the complete formation and tanning of cuticle of Caridina

米虾Bursicon-α和Bursicon-β都有一个CT结构域， 并且氨基酸序列中均含有11个半胱氨基酸残基。在C1-7、C2-8、C3-9、C4-10、C5-C11间存在二硫键， 而且C6是两个亚基即BURS和PBURS的聚合位点[9]。在C3和C4之间的氨基酸序列为X-G-X(X代表任意氨基酸残基)， C6与C7紧密相邻， C9和C10间隔一个氨基酸残基[25]。研究发现鞣化激素属于分泌蛋白， 合成以后会分泌到血淋巴中发挥作用[26，27]。米虾的bursicon-α和bursicon-β基因分别含有26和21个氨基酸的信号肽， 属于分泌蛋白， 与上述结果相吻合。目前已经在蓝蟹[21]和斑节对虾[23]中表达出了鞣化激素两个亚基基因的蛋白， 但是关于米虾鞣化激素蛋白的表达还有待进一步研究。

蜕皮周期中实时荧光定量PCR分析显示， 米虾蜕皮周期各时期里鞣化激素均有表达， 在蜕皮前期相对表达量逐渐升高， D3期时达到最大(图 3)。这个结果与以普通滨蟹为研究对象的结果相似[19，20]。这说明鞣化激素参与调节米虾蜕皮过程中表皮的鞣化过程。已知甲壳动物体的外骨骼包括上表皮层(epicuticle)、外表皮层(exocuticle)、内表皮层(endocuticle)以及膜质层(membranous layer)四层[1]。当蜕皮周期处于D0-2阶段时， 上皮细胞层会分泌几丁质酶、蛋白酶等多种酶类并向外运输， 导致膜质层和内表皮中的成分被降解， 分解后的产物可以重吸收入上皮细胞层中， 作为新表皮合成的原料[28]。此时在旧的表皮之下， 新表皮已经开始逐渐形成。上表皮最先形成， 之后在上表皮之下开始出现外表皮[29]。D3-4阶段， 肌肉与旧表皮的连接处逐渐被分解， 新表皮增厚但并没有发生钙化。AB阶段， 内表皮开始形成同时表皮发生钙化[30]。C阶段， 外表皮钙化完全， 新表皮的结构完整， 内表皮继续钙化， 整个表皮变硬[28]。鞣化激素主要是在胸腹神经节中合成， 猜测在米虾蜕皮后鞣化激素可能由胸腹神经节释放到血淋巴中， 促进米虾蜕皮后表皮的鞣化。

鞣化激素是2个亚基通过二硫键聚合形成二聚体， 所以2个亚基应该等量表达， 但在本实验中蜕皮周期里2个亚基基因的相对表达量并不相等， 猜测2个亚基可能既可以形成异源二聚体也可以单独形成同源二聚体。An等将重组BURS和PBURS同源二聚体注射到颈部结扎的黑腹果蝇中， 结果发现一些免疫相关的基因表达量增加， 重组蛋白的注射剂量和时间的差异使得免疫反应发生的程度不同。并且研究表明注射2个亚基重组二聚体蛋白的虫体匀浆液对革兰氏阴性菌Escherichia coli的生长有抑制作用。进而猜测， BURS亚基和PBURS亚基分别形成的同源二聚体可能经IMD通路与某种新受体结合参与免疫过程[14]。在米虾中关于鞣化激素与免疫的关系仍需要进一步探讨。

本研究利用RNAi技术， 使得米虾鞣化激素两个亚基的基因沉默， 实时荧光定量PCR检测敲降结果发现， 实验组在注射双链RNA 2d后bursicon-α和bursicon-β基因的相对表达量就显著下调， 说明dsRNA作用效果明显(图 4)。bursicon-β双链干扰实验中对照组第2天和第4天的表达量有一些差异(图4B)， 也许是因为这两组对照组中米虾所处的蜕皮周期不同造成的。另外我们观察到bursicon-α和bursicon-β基因相对表达量下降后米虾蜕皮周期出现了延迟(图 5、图 6)， 该结果与在赤拟谷盗中的研究结果相似[31]。同时米虾新形成表皮的角质层明显变薄(图 7)， 这一结果说明， 鞣化激素对米虾表皮角质层的增厚和鞣化起着非常重要的作用， 和前人在蓝蟹[21]、西方蜜蜂[32]中的研究结果相似。鞣化激素是一种异源二聚体， Baker和Truman[11]发现组成鞣化激素的2个亚基单独存在时并不可以产生作用， 即两者共同表达时， 才能激活受体， 发挥功能。Luo等[9]对生物活性的研究发现， 当bursicon-α和bursicon-β基因都表达时颈部结扎的红头丽蝇的表皮才能够再次鞣化， 结果表明2个亚基组成异源二聚体后才有生物活性。所以在本实验中利用双链RNA干扰技术将bursicon-α和bursicon-β分别单独敲降或共同敲降， 均可使米虾的蜕皮周期延长， 甚至角质层变薄。已有研究表明， 在昆虫中鞣化激素主要是影响了酪氨酸转变为多巴的过程[33]。但是在米虾中鞣化激素对表皮鞣化的具体调节机制尚不清楚， 需要继续探索。

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