参茸益精片对高原缺氧脑损伤中Caspase分子的影响*

霍 坚 ，王海伟 ，王自勤，苏 丹，吕宏迪△

1解放军第一五九医院，河南 驻马店 463000；2河南省武警总队医院

高原急性缺氧易引起脑损伤，对当地居民的身体健康危害严重，但其发生的分子机制复杂，影响因素众多［1-3］。阐明高原急性缺氧引起脑损伤的分子机制，探寻有效的临床治疗靶点和预防治疗方案，是目前本领域国内外研究的热点。参茸益精片主要由西洋参、黄芪等药物药组成，具有复脉固脱，补脾益肝，生津养血，安神益智壮肾阳，益精血，强筋骨等功能，可用于丙肝、乙肝常规治疗后以及肿瘤患者放化疗后白细胞减少，血红蛋白低，高原反应及消化不良等症［4-6］。但参茸益精片对于高原缺氧造成的脑损伤是否具有保护作用，其具体分子机制如何，目前尚未见相关报道。本实验以大鼠高原缺氧脑损伤动物模型为研究对象，通过Western blot和RT-PCR等实验，观察Caspase-3和Caspase-9蛋白和mRNA表达的变化，分析并阐明参茸益精片脑损伤保护作用的分子机制，为其临床应用提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 模型建立 SD大鼠18只，体质量(180～200g)，由解放军一五九医院实验动物中心提供，动物实验合格证号：DWZX2016032，随机分为空白对照组，模型组对照组和参茸益精片治疗组，每组均为6只，通过低压氧舱建立高原缺氧动物模型。空白对照组大鼠给予常规饲料喂养(由动物中心提供，总热量为11.2KJ/g)，自由饮水，饲养环境维持在25℃温度和50%湿度，明暗周期12小时/12小时；通过低压氧舱建立高原缺氧动物模型后，模型组对照组大鼠在上述饲养环境中，给予常规饲料并自由饮水，而治疗组动物在给予上述处理的同时，口服灌胃参茸益精片0.5mg/kg。8周后，检测各组大鼠脑部相关指标变化。

1.2 Caspase-9和Caspase-3活性检测 取大鼠脑组织，PBS冲洗，按Caspase活性检测试剂盒操作程序，加入裂解液，机械匀浆处理，1500 r/min离心20分钟，取上清，加入Ac-LEHD-pNA，室温放置1小时，测定吸光度值(405 nm)。

1.3 Western blot分析Caspase-3和Caspase-9表达 取大鼠脑组织，PBS冲洗，加入裂解液，机械匀浆处理，离心30分钟，12 000 r/min。BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜，5%奶粉孵育1小时，封闭非特异性背景染色，再分别加入Caspase-3和Caspase-9一抗(1∶1000)孵育，4℃过夜后，与二抗室温孵育2小时。ECL发光试剂盒发光显影，收集图像，Caspase-3和Caspase-9抗体均购自美国Abcam公司。

1.4 RT-PCR分析Caspase-3和Caspase-9 mRNA表达 分别取大鼠肝脏和主动脉组织，Tzail法提 取 总 RNA，通 过 RT-PCR分 析 Caspase-3和Caspase-9mRNA水平的变化。Tzail试剂购自美国invitrogen公司。Caspase-3上游引物：5′-CAGACAGTGGAACTGACGAT-3′，下 游 引 物 ：5′-TTTCAGCATGGCGCAAAGTG-3′；Caspase-9 上游引物 5′-CAGTGGGCTCACTCTGAAGACC-3′，下 游 引 物5′-ACGCGTTACTGGCATTGAGG-3′；β-actin 上游引物：5′-GAAGTGTGACGTTGACAT CCG-3′，β-actin 下游引物:5′-GCCTAGAAGCATTTGCGGTG-3′，引物由上海碧云天生物技术公司设计。琼脂糖凝胶(1%)电泳分离RT-PCR产物(Bio-Rad公司电泳仪)，凝胶成像仪观察图像，分析组间差异。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件分析数据，各组间差异采用t检验比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 参茸益精片对Caspase-3和Caspase-9活性的影响 高原缺氧造成脑损伤后，与空白对照组相比较，大鼠脑组织中大鼠肝脏中Caspase-3和Caspase-9活性显著增加(P＜0.05)。参茸益精片治疗组的动物，与模型组相比，Caspase-3和Caspase-9活性均显著降低(P＜0.05)。见表1。

表1 参茸益精片对Caspase-3和Caspase-9活性的影响

2.2 参茸益精片对Caspase-3和Caspase-9 mRNA表达的影响 与空白对照组相比较，模型组动物脑组织中Caspase-3和Caspase-9 mRNA表达均明显增加(P＜0.05)；参茸益精片治疗组的动物，与模型组相比，脑组织中Caspase-3和Caspase-9 mRNA表达显著降低(P＜0.05)。见图1。

图1 参茸益精片对Caspase-3和Caspase-9 mRNA表达的影响

2.3 参茸益精片对高原缺氧脑损伤大鼠Caspase-3和Caspase-9表达的影响 模型组大鼠，与空白对照组相比较，脑组织中Caspase-3和Caspase-9表达显著增加(P＜0.05)，而经过参茸益精片治疗的动物，与模型组相比，脑组织中Caspase-3和Caspase-9表达显著降低(P＜0.05)。见图2。

图2 参茸益精片对Caspase-3和Caspase-9表达的影响

3 讨论

参茸益精片的主要有效成分是人参皂苷(Ginsenoside)Rg1、Re 和黄芪甲苷(Astragaloside A)，具有复脉固脱，补脾益肝，生津养血的功效，可以达到疏通脉管，改善脏器供血，调节人体代谢功能的目的［7-8］。高原急性缺氧易引起脑损伤，在高原地区的临床发病率持续增高，其发生的分子机制复杂，影响因素众多。分析并阐明参茸益精片保护高原急性缺氧引起的大鼠脑损伤的分子机制，将为其临床应用提供实验基础和理论依据。本研究中，我们通过建立大鼠高原急性缺氧模型，观察参茸益精片对缺氧大脑的保护作用，以阐明参茸益精片的作用机制，为其进一步的临床应用提供实验基础和理论依据。

本研究发现，Caspase-3和Caspase-9与大鼠高原急性缺氧造成的脑损伤密切相关，与空白对照组相比较，高原急性缺氧模型大鼠脑组织中Caspase-3和Caspase-9表达均明显增加，参茸益精片治疗组的动物，与模型组相比，Caspase-3和Caspase-9表达均显著降低。通过RT-PCR实验，上述分子的mRNA表达水平也体现一样的趋势。以上结果提示，参茸益精片具有显著的脑保护作用，具有潜在的临床应用前景。

综上所述，参茸益精片能够显著高原急性缺氧模型大鼠脑组织相关分子的表达，可能作为临床治疗并预防急性缺氧脑损伤的药物。

参考文献

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