芪苈强心减轻阿霉素诱导的小鼠心脏损伤

武晓栋,姜惠敏,姚文明,高蓉蓉,李新立

阿霉素(doxorubicin,DOX)是临床治疗中常用的一种蒽环类抗肿瘤药物,因其具有作用的广谱性及疗效的确定性,被广泛应用于多种肿瘤的治疗[1-2].然而DOX对多种器官存在毒性副作用,尤其是心脏毒性作用.这也增加了患者心血管疾病的患病率与死亡率,极大地限制了DOX为临床应用.在用药开始阶段心肌损害程度不甚严重时,患者往往没有明显的临床症状;而当心肌损害进一步发展出现慢性心力衰竭时,可以出现一系列与心力衰竭相关的临床症状.一旦出现这些症状,患者的病死率可高达30%～50%[3-5].因此,寻找有效的治疗措施对于改善DOX心肌病的预后,以及扩大DOX临床应用范围至关重要.

对于DOX所致心脏毒性的研究发现,DOX可引发心肌细胞的炎症反应及线粒体氧化应激[6],改变心脏超微结构并导致DNA损伤,甚至于心肌细胞的大量凋亡[7],最终导致心肌病的发生,其中线粒体功能损害被认为是DOX心脏毒性的重要组成部分[6-10].

芪苈强心(Qiliqiangxin,QLQX)是在络病理论指导下研制的治疗慢性心力衰竭的现代特色中药.已有研究表明,QLQX可以稳定心肌细胞的线粒体结构,改善线粒体功能,抑制心肌组织中的氧化应激过程,从而有效调控心肌能量代谢[11-13].本工作探究了QLQX对DOX诱导的小鼠心脏损伤的治疗作用.

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠,7～9周龄.所有实验操作均按照南京医科大学的相关规定,并通过南京医科大学伦理委员会的审批.

1.1.2 实验材料

阿霉素(Sigma);实时荧光定量多聚酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)相关试剂,包括Trizol(Invitrogen)、逆转录试剂盒(Bio-Rad)、SYBR Green(Bio-Rad)、384孔PCR板(ABI).

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验方案

本工作将7～9周龄的C57BL/6雄性小鼠随机分为两批:①对照组(n=5),DOX注射组(n=5);②对照组(n=5),DOX注射组(n=3),DOX注射+QLQX给药组(n=4).DOX注射组按照4 mg/kg的剂量向小鼠腹腔注射DOX,每周1次,持续4周;对照组则给予同样剂量的生理盐水.DOX注射+QLQX给药组在注射DOX的同时,按照0.5 g/(kg·d)的剂量给予QLQX治疗,持续4周.

1.2.2 心脏超声检查

使用2%的异氟烷麻醉小鼠后,通过Vevo 2100(Visual Sonics Inc)进行心脏超声检查,评估各组小鼠的心功能变化.

1.2.3 qRT-PCR

使用Trizol提取心脏组织中的总RNA.定量选取400 ng总RNA进行逆转录,获取样本cDNA.以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参基因,利用特异性的引物及SYBR Green进行qRT-PCR,以检测目标基因在样本中的表达水平.本工作所使用的引物序列如表1所示.

1.2.4 统计学分析

运用GraphPad Prism 6.0统计软件进行统计学分析,所有数据均以“均值±标准差”的形式表示.两组样本比较使用独立样本t检验,多组样本比较使用单因素方差分析进行统计,并以Bonferroni作两两比较,P＜0.05认为差异有统计学意义.

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 List for the primers used for qRT-PCR

2 实验结果

2.1 DOX诱导小鼠心功能损伤

本工作使用Vevo 2100进行心脏超声检查,评估DOX对心脏的毒性作用.结果发现,随着DOX累计注射剂量的增加,小鼠的心功能指标,包括射血分数、短轴缩短率均明显降低(见图1,其中***表示P＜0.001).由此可知,DOX可引起小鼠心功能损伤,使小鼠心功能水平明显下降.

图1 注射阿霉素后的小鼠心功能指标Fig.1 Injection of DOX induced cardiac dysfunction in mice

2.2 DOX导致的线粒体氧化呼吸链以及DNA损伤

采用qRT-PCR检测了小鼠心脏组织中与线粒体氧化呼吸链及DNA损伤相关的基因的表达情况,结果如图2和3所示,其中*表示P＜0.05,**表示P＜0.01,***表示P＜0.001,n=5.由图2可知,DOX可以使小鼠心脏组织中与线粒体氧化呼吸链相关的基因的表达情况发生明显变化,其中Ndufa8与ATP6V1E的表达明显升高,而ATP5G1与ATP5H则显著下降.由图3可知,DOX在心脏组织诱发了严重的DNA损伤,其中相关的ATM,ATR及CHK2的表达均显著下降.

图2 注射阿霉素后,与线粒体氧化呼吸链相关的基因的表达Fig.2 Expression of the oxidation respiratory chain-related genes after the injection of DOX

图3 注射阿霉素后,与小鼠心肌组织相关的基因表达Fig.3 Expression of the myocardium related genes in mice after the injection of DOX

2.3 QLQX减轻阿霉素对小鼠的心功能损伤

本工作使用Vevo 2100进行心脏超声检查,评估各组小鼠的心功能状况,明确QLQX是否能对小鼠心功能发挥保护作用,结果如图4所示,其中***表示P＜0.001,n=3～5.可见,DOX可引起小鼠射血分数和短轴缩短率的明显下降,而QLQX可改善上述两个指标,对DOX所致心脏损伤表现出了一定的保护作用.

3 讨论

越来越多的研究表明,DOX严重的心脏毒性及其在心脏的蓄积,使患者的心血管事件发生率随累积剂量的增加而逐渐增高.但对于DOX等蒽环类药物对机体器官副作用的拮抗治疗研究仍进展缓慢[4,14].线粒体损伤被认为是DOX所致心脏毒性作用的重要组成部分.DOX的注射可引起线粒体超微结构的改变,阻碍线粒体DNA的合成,影响心脏的能量代谢过程[1,8,15].本研究结果也同样表明了DOX可阻碍线粒体的氧化代谢过程,引起DNA损伤,使得心脏功能明显受损.

图4 QLQX治疗后,DOX注射小鼠的心功能状况Fig.4 Cardiac function in DOX injected mice after QLQX treatment

本工作首先探讨了中药QLQX是否可缓解DOX所致心脏毒性作用.QLQX是在络病理论指导下研制的治疗慢性心力衰竭的现代特色中药.实验结果表明,QLQX可以通过激活PGC-1α增强线粒体DNA的复制及转录过程,促进线粒体的合成,改善线粒体的能量代谢过程[11-13];经过QLQX给药治疗后,注射DOX小鼠的心功能得到了明显改善,提示QLQX对DOX所致心脏损伤具有治疗作用.

本工作还存在很多不足之处,比如未能探讨QLQX对于DOX所致心脏损伤保护作用的相关分子机制,但这也为下一步的深入研究提供了方向.总的来说,本实验结果证实了QLQX可以减轻DOX诱导的心脏损伤,并为临床治疗DOX所致心脏毒性提供了更多的药物选择.