毛冬青叶多酚的提取工艺及其抗氧化性质的研究

唐婷范，杜丹丹，邓起东，姚增辉，田玉红

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006）

毛冬青（Ilex pubescens Hook.et Arn），是属于冬青科冬青属常绿灌木或小乔木，它在我们生活中还被我们叫做乌尾丁、美仔蕉等。已对毛冬青根的化学成分、药理活性及临床应用等方面进行了比较系统的探讨，其化学成分包括黄酮、香豆素、萜烯、酚类物质、甾体、单宁、糖、氨基酸等[1-8]，毛冬青根资源有限，且不可再生，而叶资源丰富，且为可再生资源。但至今国内罕有文献对毛冬青叶的化学成分进行报道[9-10]，《浙江民间常用草药》记录：黑色尾叶，味苦，清热，消炎；治疗牙周炎，牙周炎疮，带状疱疹，脓疱疮[11]。

多酚是一类广泛存在于植物中的化合物。大量的数据表明植物多酚具有重要的生理活性。抗氧化，抗氧化，抗肿瘤，抗肿瘤和抗心脑血管疾病具有显着的效果，作为功能性食品添加剂，可广泛应用于食品和医药领域[12]。21世纪以来，国内外在植物多酚方面的探讨报道较多[13-15]，但有关毛冬青叶多酚的探讨鲜见报道，为了综合利用资源，扩大药源，为毛冬青叶的开发利用奠定基础，本试验对毛冬青叶多酚提取工艺及提取液的抗氧化活性进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

毛冬青叶：产于云南。没食子酸、罗氏盐、酸性磷酸钠、磷酸氢二钠、烧碱、香兰素、H2O2、绿矾、邻羟基苯甲酸（均为国产分析纯）：西陇科学股份有限公司；二苯基苦基肼自由基DPPH·（分析纯）：Wako公司产品；D301大孔树脂：沧州宝恩吸附材料科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津公司；Paragon500 FTIR红外光谱仪：美国PerkinEImer；722N可见分光光度计、pHS-3C型精密pH计、电子天平：上海精密科学仪器有限公司：RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：金坛市医疗仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 毛冬青叶多酚成分的提取

按照参考文献[16]将毛冬青叶烘干粉碎，过20目筛。准确称取一定量的原料，加入一定料液比的浸提溶剂，于一定温度下回流浸提一定时间，浸提液在3 000 r/min转速下离心20min，取上清液用722 N可见分光光度计测定吸光度，将浸提液浓缩后真空干燥，干燥物置于4℃～6℃冰箱中保存，等待使用。

1.3.2 毛冬青叶抗氧化成分析

采用特征显色反应（分别与明胶、三氯化铁、甲醛-盐酸和茴香醛-硫酸试剂反应）[17]、采用D301树脂对提取液纯化后进行紫外可见吸收光谱和红外光谱定性分析。

1.3.3 多酚含量的测定

按参考文献[18]配制没食子酸标准溶液，以酒石酸亚铁为显色剂，采用分光光度法对毛冬青叶多酚得率进行测定。

1.3.4 毛冬青叶中多酚化合物的抗氧化性质

将浸提的毛冬青叶多酚配成不等同质量浓度的水溶液，分别运用Fenton与DPPH法[19]，测定各试样不等同浓度时的A525nm与A517nm，并计算其对OH自由基和DPPH自由基的消除率。

2 结果与讨论

2.1 毛冬青叶抗氧化成分表征

2.1.1 特征显色反应

提取液与显色剂的显色反应结果如表1所示。

表1 提取液的显色反应Table1 Colour developm ent reaction of extraction

由表1可知，提取液具有多酚的显色特征，初步推断出毛冬青叶中含有酚羟基类成分。

2.1.2 紫外可见光及红外光谱分析

对毛冬青叶提取物进行紫外可见光和红外光谱分析，结果见图1。

图1 试样的紫外可见光和红外光谱分析图Fig.1 UV absorption and FT-IR spectrum of samples

紫外可见光光谱图1（a）以没食子酸标准品为对照。从图1可知，毛冬青叶提取液与没食子酸在260nm处均有强吸收，可推断毛冬青叶含多没食子酸为主的多酚类化合物。

红外光谱如图1（b）以没食子谱图为参照。从图1可知，提取物具有没食子酸多酚类的部分特征吸收峰，如3 400 cm-1处有很强的O-H伸缩振动，峰形宽大，吸收峰强，3 063 cm-1～2 978 cm-1为羧基O-H伸缩振动，1 322 cm-1为O-H面内弯曲振动，1 703 cm-1为羧基C=O伸缩振动，766 cm-1有芳香环的不饱和C-H面外变形振动产生的吸收，642 cm-1为O-H面外弯曲振动，1 600 cm-1左右为苯环骨架吸收峰等，由此分析可大致认为毛冬青叶抗氧化主要成分为没食子酸类多酚物质[20]。

综合以上试验结果可初步推断，试验提取得到的毛冬青叶抗氧化成分可能属于水解单宁类化合物，但其具体种类及结构有待进一步确定。

2.2 毛冬青叶多酚的定量分析

2.2.1 没食子酸的标准工作曲线

以没食子酸为标准品，在浓度为0～12μg/mL范围内，吸光值与浓度程直线关系，结果见图2。

图2 没食子酸标准曲线Fig.2 Standard curveof pyrogallic acid

回归标准曲线方程：y=0.018 94x+0.007 37，相关系数为R2=0.999 1，式中：x为没食子酸标准溶液浓度，μg/mL；y为吸光度A。

2.2.2 精密度、重现性和加标回收结果

精密度试验按1.3.1方法制备一份样品溶液，来回测定6次，计算RSD，试验结果见表2。

表2 精密度试验结果（n=6）Tab le2 Resultsof precision experiments（n=6）

由表2可知，精密度试验的RSD为1.51%，表明该测定方法的精密度良好。重现性试验：在同一要求下，回流浸提得到6份浸提液，测定并计算RSD，试验结果见表3。

表3 重现性试验结果（n=6）Table3 Resultsof reproducibility experiments（n=6）

由表3可知，稳定性试验的RSD为1.41%，表明该测定方法比较稳定。

加标回收试验：精密量取相同体积样品溶液5份，分别加入不等同体积的没食子酸标准溶液，测定总多酚含量，按回收率/%=（实测值－样品所含的总多酚）/加入的没食子酸标样×100计算，得到平均回收率和RSD，试验结果见表4。

表4 加标回收率试验结果（n=5）Table4 Resultsof recovery experim ents（n=5）

由表4可知，平均加标回收率为98.68%，RSD为1.17%。以上结果表明，该测定方法的精密度、稳定性和准确度良好，适用于毛冬青叶多酚含量的测定。

2.3 毛冬青叶多酚提取条件优化

2.3.1 溶剂pH值对多酚得率的影响

称取2.0 g毛冬青叶，加入料液比为1∶30（g/mL），不一样pH值（3～10）的水，于50℃温度下回流提取1次（2 h），结果如图3所示。

pH=4中多酚的得率高，可能是由于多酚类物质普遍与植物中的碱有关。适量的酸，容易释放酚酸，对于高聚合度的缩合，冷凝液比酸溶液更容易浸出，但它易于氧化多酚，因此，pH=4的蒸馏水是在下面的试验进行的。

图3 溶剂pH值对多酚得率的影响Fig.3 Theeffectof pH valueon yield of polyphenol

2.3.2 提取时间对多酚得率的影响

首先称2.0 g毛冬青叶，然后加入料液比为1∶30（g/mL）的水，其中pH=4，于50℃下分别以不同时间回流提取1次，结果如图4所示。

图4 提取时间对多酚得率的影响Fig.4 Theeffectof extraction timeon yield of polyphenol

1.5 h内随着提取时间的增加，多酚的得率大大提高。在那之后，它显然呈现下降的趋势。可能的原因是，在初始阶段，多酚的扩散速度较快，多酚的得率较高。1.5 h的扩散趋于平衡，浸出率降低。一些酚类物质被认为是很容易被氧化在空气中，故提取时间以1.5 h为宜。

2.3.3 提取温度对多酚得率的影响

称取2.0 g毛冬青叶，加入料液比为1∶30（g/mL）的水（pH=4）。同时，于不同温度下回流提取1次（1.5 h），结果如图5所示。

多酚化合物的得率随温度的升高而增加。当温度达到50℃时，多酚的得率明显降低。可能是因为温度升高，溶剂的渗透能力和溶解性得到了提高，但多酚的过度氧化造成了生物活性的丧失，因此可取的提取温度为50℃最合适。

多酚化合物的得率随温度的升高而增加。当温度达到50℃时，多酚的得率明显降低。可能是因为温度升高，溶剂的渗透能力和溶解性得到了提高，但多酚的过度氧化造成了生物活性的丧失，因此可取的提取温度为50℃最合适。

图5 提取温度对多酚得率的影响Fig.5 The effect of extraction temperature on yield of polyphenol

2.3.4 提取料液比对多酚得率的影响

称取2.0 g毛冬青叶，加入不同料液比的水（pH=4），于50℃下回流提取1次（1.5 h），结果如图6所示。

图6 料液比对多酚得率的影响Fig.6 Theeffectof ratio of liquid to solid on yield of polyphenol

随着液料比例的增加，多酚的溶出速率也在增加，原因可能是液体比例的增加将大大提高传质率和传质力。当料液比为1∶30（g/mL）时，多酚得率达到最大。之后，多酚的得率随着固液平衡的增加而降低，有吸附和吸附的平衡，低温有利于吸附。随着溶剂用量的增加和相同量的热，提取液的温度下降和吸附能力的提高，导致多酚的得率下降。同时考虑到溶剂用量过大，增加后续试验的工作量。因此，以1∶30（g/mL）为合适的料液比。

2.3.5 提取次数对多酚得率的影响

称取2.0 g冬青叶（过20目），加入料液比为1∶30（g/mL）的水（pH=4），于50℃下回流浸提不同次数，每次浸提1.5 h，结果如图7所示。

提取次数为1次时，多酚得率约为2.59%，第2次得率为2.91%，得率也比第1次提高0.32%，提取3次～5次时，得率基本趋于平缓。可能是因为第1、2次提取时，毛冬青叶中的多酚已经基本溶解到溶剂里面了，由此看来，毛冬青叶提取1次之后，如果再次提取的话，没有很大的实际意义，加上考虑成本因素，故提取次数1次为佳。

图7 提取次数对多酚得率的影响Fig.7 Theeffectofextraction timeson yield of polyphenol

2.3.6 毛冬青叶多酚的正交试验

在单因素试验的基础上，选择前4个因素进行L9（34）正交试验设计，方案如表5所示。

表5 正交试验因素水平表Table5 Factorsand levelsof orthogonalexperiment

以毛冬青叶多酚得率为评价指标，优化总多酚的最适合提取工艺，结果见表6。

表6 正交试验及其结果分析Tab le6 Resultsof theorthogonalexperiment

续表6 正交试验及其结果分析Continue table6 Resultsof theorthogonalexperiment

由直观剖析可以得到，2号试验的结果显示的是最适合，其相对应的优化组合为A1B2C2D2；由极差R剖析可以得到，毛冬青叶多酚浸提要求因素的主次顺序为浸提时间＞pH值＞浸提温度＞料液比。根据正交要求的统一比较，各因素的最佳组合是最优水平组合，即B2D2A2C2。试验结B2D2A2C2条件下提取的多酚得率最高为2.89%，这次测定的含量均高于之前每次试验测定的含量是最适合的结果。

2.4 毛冬青叶多酚的抗氧化性研究

毛冬青叶多酚对·OH的清除作用，以没食子酸做对照，结果如图8所示。

图8 不同浓度试样对·OH清除率曲线Fig.8 Hydroxyl free radicalscavenging ratesof differentsam ples

在较低浓度时，样液的清除作用较弱，但随着其浓度增加，清除作用快速增强。当浓度达到1.5mg/mL时，样液的清除能力基本不变，可能原因是试液中的有效物质被氧化。在试验浓度范围内，样液是在1.5mg/mL时对·OH有最大清除率，清除率为55.00%。样液和没食子酸溶液在试验浓度范围内对·OH清除作用变化趋势相似。由此可知，样液和没食子酸一样，含有供氢体，可还原氧化性的自由基，从而能终止自由基连锁反应，以清除自由基。毛冬青叶多酚对DPPH·的清除作用，以没食子酸做对照，结果如图9所示。

在较低浓度时，样液对DPPH·有很高的清除率，且清除效果与标准液的清除效果变化趋势相同，当浓度达到1mg/mL时，但清除率增加幅度不大。在试验浓度范围内，样液对DPPH·的清除率的最大值为62.85%。

图9 不同浓度试样对DPPH·的清除率曲线Fig.9 DPPH free radicalscavenging ratesof differentsam ples

3 结论

毛冬青叶中含多酚类抗氧化成分，且最适合浸提工艺要求下多酚得率为2.89%。在试验浓度范围内，该多酚提取液对·OH与DPPH·的清除率分别达55.00%与62.85%，具备一定的清除自由基作用。

采用的回流浸提方法，其具备操作简单，方法稳定的特点，另外乌尾丁叶多酚具备一定的抗氧化作用，近年来，随着植物抗氧化成分的发展，食物中的植物抗氧化物质，因此，化妆品和药物的使用日益增多，因此，作为功能性食品添加剂的多酚类食品具有广泛的应用和发展前景。这对毛冬青的综合利用和进一步发展具有重要意义。

参考文献：

[1]郑虎占,董泽宏,余靖.中药现代研究与应用[M].北京:学苑出版社,1997:1036-1044

[2]Lin Li-Ping,Li Ying,Zhang Ji-Chao,et al.Biomarkers for Ilex pubescens under anti-platelet activity-oriented isolation[J].BiochemicalSystematicsand Ecology,2015,61:8-11

[3]Peng Wu,Hui Gao,Zhong Huang Li,et al.Two new triterpene saponins from the rootsof Ilex pubescens[J].Phytochemistry Letters,2015,12:17-21

[4]Yuan Zhou,Kewu Zeng,Jiayu Zhang,etal.Triterpene saponins from the rootsof Ilex pubescens[J].Fitoterapia,2014,97:98-104

[5]Xiao-Qing Chen,Ke Zan,Jie Yang,et al.Quantitative analysis of triterpenoids in differentpartsof Ilex hainanensis,Ilex stewardii and Ilex pubescens using HPLC-ELSD and HPLC-MSn and antibacterialactivity[J].Phytochemistry Letters,2011,126:1454-1459

[6]王明艳,鲁加峰,宋瑛,等.响应面法优化毛冬青根黄酮提取条件[J].食品科学,2011,32(18):81-85

[7]周渊,李宁,张加余,等.RP-HPLC-DAD法同时测定毛冬青根中4种三萜皂苷和2种木脂素的含量[J].中国药学,2014,23(12):866-872

[8]林培燕.毛冬青活性成分及其药代动力学研究[D].北京:北京协和医学院,2013

[9]冯华芬.毛冬青叶化学成分研究[D].桂林:广西师范大学,2012

[10]周渊,周思祥,姜勇,等.毛冬青叶的化学成分研究[J].中草药,2012,43(8):1478-1483

[11]浙江卫生局.浙江民间常用草药[M].杭州:浙江人民出版社,1972

[12]郭新竹,宁正祥.天然酚类化合物及其保健作用[J].食品工业,2002(3):28-29

[13]Jatinder Pal Singh,Amritpal Kaur,Narpinder Singh,et al.In vitro antioxidant and antimicrobial properties of jambolan(Syzygium cumini)fruitpolyphenols[J].LWT-Food Science and Technology,2016,65:1025-1030

[14]朱素英.响应面法优化三七花多酚的提取工艺及其抗氧化性分析[J].食品科学,2015,36(10):65-69

[15]唐婷范,刘雄民,凌敏,等.蒜头果皮果肉抗氧化成分提取及其抗氧化性质研究[J].食品科学,2012,33(2):16-19

[16]唐婷范.蒜头果有效成分及其生物活性研究[D].南宁:广西大学,2013:74

[17]孙达旺.植物单宁化学[M].北京:中国林业出版社,1992

[18]欧阳玉祝,陈小东,唐红玉,等.路边青中总多酚的提取与分离研究[J].食品科学,2009,30(16):44-47

[19]赵艳红,李建科,李国秀.天然抗氧化物体外活性评价方法的优选与优化[J].食品科学,2008,29(6):64-69

[20]王广娟.五倍子没食子酸的提取、纯化及抑菌效果研究[D].保定:河北农业大学,2010:38-39