一株耐铝甜瓜枯萎病拮抗细菌的分离鉴定及其耐铝特性研究

李怡 彭文涛 李勤奋 邓晓 吴东明 谭华东 武春媛

摘 要 从甜瓜根际酸性土壤中分离筛选到1株耐铝甜瓜枯萎病拮抗菌，命名为A2。根据表型、生理生化特征和16S rRNA基因序列相似性分析，將其鉴定为Pseudomonas sp.。菌株A2对甜瓜枯萎病病原菌的相对防效为68.3%，且拮抗能力具有遗传稳定性。相比AlCl3处理，菌株A2对Al2（SO4）3表现出了更好的耐受性，最高可耐受Al3+ 50 mmol/L。在含有A13+的S-LB培养基中，菌株最适生长温度为30 ℃；培养基初始pH值的降低会加剧A13+对菌株A2的毒害作用。研究结果为含活性铝的酸性土壤中甜瓜枯萎病的生物防治提供优良菌株资源和理论基础。

关键词 耐铝；细菌；甜瓜枯萎病拮抗菌；耐铝能力；耐铝特性

中图分类号 S154.3 文献标识码 A

Isolation， Identification of An Aluminum-tolerant Bacteria Strain Antagonizing Fusarium Wilt of Muskmelon and Its Al-tolerant Characteristics

LI Yi1，2， PENG Wentao1， LI Qinfen1，2， Deng Xiao1，2， Wu Dongming1，2， Tan Huadong1，2， Wu Chunyuan1，2*

1 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

2 Experiment Station of Agricultural Environment Scientific Observation in Danzhou， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract An aluminum-tolerant bacteria strain antagonizing fusarium wilt of muskmelon， A2， was isolated from the rhizospheric soils of muskmelon. Based on the phenotypic， physiological， biochemical characteristics and phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences， it was identified as Pseudomonas sp.. A2 showed strong antagonistic effect against Fusarium oxysporum and its relative control effect was 68.3%. A2 showed higher tolerant ability for Al2（SO4）3 than AlCl3， and it was tolerant to 50 mmol/L Al3+. The optimal temperature for the growth of A2 in medium containing Al3+ was 30 ℃， and the decreasing initial pH of the medium aggravated the toxic effect of A13+ on strain A2. This study would provide a new resource and theoretical basis for the biocontrol of fusarium wilt of muskmelon in acid and aluminum soils.

Key words aluminum-tolerance； bacteria； bacterium antagonizing fusarium wilt of muskmelon； Al-tolerant ability； Al-tolerant characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.021

我国酸性土壤遍布南方15个省市，总面积达2.03×108 hm2，约占全国耕地面积的21%[1]。酸性土壤中，活性铝易以离子态释放到土壤中，对植物、微生物具有非常大的毒害作用[2-3]。在酸性土壤中，铝毒导致钾、钙等营养元素缺乏；铝易在根中大量积累，干扰植物养分的吸收及运输，是限制植物生长的主要因子之一[4]。铝作用于微生物细胞的细胞壁、细胞膜、细胞核和多种细胞器，影响微生物的物质和能量代谢，抑制微生物的生长和发育。土壤中的富铝化作用随着酸性沉降及酸性肥料的大量施入而加剧，环境中活性铝的数量呈明显增加的趋势[5]。

微生物具有生长快、易变异等特点。经铝毒胁迫后而存活的土壤微生物，其解铝毒能力是决定铝毒危害程度的重要因素[6]。细菌在微生物中所占比例最大，与真菌相比，具有易培养、生长速度快、遗传背景相对简单等特点。耐铝微生物，尤其是耐铝细菌，可为耐铝机制研究提供合适的模式生物体，为耗时较长的植物耐铝新品种培育提供理论基础。

甜瓜是我国的重要水果作物，但在酸性土壤中受铝毒害严重，易发生甜瓜枯萎病。甜瓜枯萎病是由甜瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp.Melonis）引起的土传病害，被称为瓜类作物的“癌症”。土壤中一旦存在甜瓜枯萎病菌将很难被根除，在连作地上表现尤为明显[7]。目前，生物防治为甜瓜枯萎病的主要防治手段。生物防治是利用生物的代谢产物或生物体本身来拮抗病原菌，来源一般为自然界本身，对环境和人类安全无害，但须通过人为定量添加生防菌株至土壤中使其增殖，生防菌株在施用后普遍因不适应土壤环境而定殖能力不强，导致应用时防治效果较差。因此，铝毒土壤中甜瓜枯萎病拮抗菌的定殖能力，成为关系甜瓜产量的重要因素。

甜瓜枯萎病拮抗菌的分离筛选已有研究报道，菌株种类包括木霉菌属[8]、放线菌[9]、芽孢杆菌属[10-11]等。生防菌株要具备耐铝特性，才可成功应用于有铝毒的酸性土壤，但国内外目前均无报道表明生防菌株具有耐铝特性。本研究针对甜瓜大部分生长环境为铝毒土壤，铝胁迫较严重，易感染甜瓜枯萎病，且拮抗菌在铝毒土壤中定殖能力较低、生物防治效果不理想的实际情况，试图从土壤中分离出耐铝甜瓜枯萎病拮抗菌，研究其耐铝特性，为提高生防菌株在原位条件下的耐铝效果及定殖能力提供新的资源和思路。

1 材料与方法

1.1 材料

土壤样品，取自海南澄迈甜瓜根际砖红壤，采集地表5～15 cm土壤，pH值为5.13。

甜瓜枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f. sp.Melonis）FJAT-9230，来源于福建省农业科学院农业生物资源研究所农业微生物研究中心。

50 %多菌灵可湿性粉剂，购自江苏扬农化工有限公司。

Pseudomonas azotoformans DSM 18862，購自德国微生物菌种保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 耐铝甜瓜枯萎病细菌的分离筛选及拮抗指数、遗传稳定性、相对防效的测定 参照小西茂毅等的方法配制S-LB培养基[12]。在90 mL含20 mmol/L Al3+、pH 5.0的S-LB液体加10 g土壤样品，于30 ℃、180 r/min振荡培养24 h，梯度稀释后涂布于固体S-LB 培养基上，30 ℃培养5 d，待平板出现单菌落后，挑取菌落形态不同的单菌落在S-LB培养基平板上划线纯化，直至单菌落形态一致且细胞染色在显微镜下观察形态一致。

将筛选到的耐铝细菌，参照邹立飞[13]的方法，稍加改进，进行平板对峙、继代培养、相对防效测定试验。

平板对峙试验：以甜瓜枯萎病病原菌FJAT-9230为指示菌，将病原菌活化后，用孔径5 mm 的打孔器制成菌饼，取1块菌饼到PDA 平板中央，将待测菌株点接于距平板中心25 mm处的4个点上， 30 ℃培养5 d后，测定该PDA培养基中上述菌株的抑菌圈半径、拮抗菌半径，计算拮抗指数。

抑菌圈半径=拮抗菌菌饼中心至病原菌菌丝边缘的距离

拮抗指数=（抑菌圈半径﹣拮抗菌半径）/拮抗菌半径。

继代培养试验：将菌株连续传代，逐代进行平板对峙试验，计算拮抗指数，确定菌株抑菌活性的稳定性。

相对防效测定：盆栽土壤为砖红壤，pH值为4.98。将病原菌FJAT-9230制成孢子悬浮液（浓度为1×106 cfu/mL），拮抗菌制成1×108 cfu/mL菌悬液，甜瓜（金辉1号）缓苗后，接种拮抗菌株和病原菌液，二者接菌量为10 mL，以只接种病原菌、清水和50%多菌灵可湿性粉剂500倍液作为阴性和阳性对照，每个处理10盆，每盆1株甜瓜苗，3次重复。7 d后观察发病情况，15 d后计算发病指数和相对防效。

甜瓜苗期枯萎病分级标准[14]：0级，茎基部无褐变；1级，茎基部褐变；2级，茎基部1/2处褐变；3级，茎基部2/3处以上褐变；4级，茎基部到顶端所有维管束褐变，根部坏死。

病情指数=[Σ（病级株数×病害级数）/（该处理盆栽苗总和×发病最重级的代表数值）]×100。

相对防治效果=[（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数] ×100%。

1.2.2 菌株形态观察、生理生化特征的确定及分类地位分析 菌株菌落形态、生理生化特征的确定参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]和《Bergey's Manual of Determinative Bacteriology》[16]。

菌体总DNA的提取方法为改良CTAB法 [17-18]。

菌株16S rRNA基因的PCR扩增以其基因组DNA为模板，采用通用引物。正向引物为5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′，反向引物为5′-TACCTTGT TACGACTT-3′[19]。

扩增体系（50 μL）如下：10×Buffer 5.0 μL，Mg2+（25 mmol/L） 4.0 μL，dNTP（10 mmol/L）

5.0 μL，正向引物（25 μmol/L） 1.0 μL，反向引物（25 μmol/L） 1.0 μL，菌株基因组DNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL，灭菌双蒸水

至50 μL。

PCR扩增反应程序为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，

56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共30个循环；72 ℃ 10 min，10 ℃ 10 min。PCR产物通过1%，GoldView染色的琼脂糖电泳后，凝胶成像仪检测。用DNA凝胶回收试剂盒回收基因片段，TA克隆后进行测序（由华大基因完成）。根据16S rRNA 基因的测序结果，在http：// eztaxon-e.ezbiocloud.net/下载同源性较高的16S rRNA基因序列[20]，用MEGA version 5.0 软件采用邻接法[21]构建降解菌株的 16S rRNA基因系统发育进化树[22]。

1.2.3 不同形态Al3+处理对菌株生长的影响 参照王超等[23]的方法，稍加改动。将不同形态的Al3+[AlCl3、Al2（SO4）3]灭菌后加入S-LB培养基中，Al3+终浓度为30 mmol/L。将菌株用不加Al3+的S-LB培养至OD600=0.5，以2%接种量接种于含不同形态Al3+的S-LB中，于30 ℃、160 r/min培养72 h，定时取样，测定OD600，以菌株在不含Al3+的S-LB培养基上的生长情况作为对照，每个处理做3个重复，绘制菌株在含有不同形态Al3+的S-LB培养基中的生长曲线。

1.2.4 菌株耐铝能力分析 菌株耐铝能力的测定采用点接法。制备菌液，离心，无菌蒸馏水洗涤2 次后重新悬于1 mL 无菌蒸馏水中，调至OD600值为0.5。将重悬后的菌液再稀释10、100倍后，各取3 μL点涂于含不同浓度（0、10、30、50、60 mmol/L）Al3+[[Al2（SO4）3]的固体S-LB培养基上，30 ℃培养，以分类地位较为接近的Pseudomonas azotoformans DSM 18862作为对照，3 d 后观察培养结果。

1.2.5 pH对菌株在Al3+中生长的影响 设置S-LB培养基（含30 mmol/L Al3+）的pH值分别为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，以无菌水调节菌悬液浓度至OD600=0.5，2%接种量，分别接种于上述培养基中，30 ℃培养3 d，以菌株在不加Al3+的各pH值培养基的生长情况作为对照，每个处理做3个重复，测定菌株OD600。

1.2.6 温度对菌株在Al3+中生长的影响 在S-LB培养基中加入Al3+，其终浓度为30 mmol/L，pH 5.0，无菌水洗菌，调至OD600=0.5，2%接種量，分别于不同的培养温度下（20、25、30、35、40 ℃）培养3 d，每个处理做3个重复，测定菌株OD600。

1.2.7 阳离子对菌株生长的影响 参照王超等[23]的方法，稍加改动。在pH 5.0的S-LB培养基中分别加入Na2SO4、K2SO4、MgSO4、Al2（SO4）3 ，使各阳离子的终浓度分别为90、90、45、30 mmol/L。将OD600值为0.5的菌液以2%接种量加入，以菌株在不含任何阳离子的S-LB培养基上的生长情况作为对照，30 ℃培养3 d，每个处理做3个重复，测定菌株OD600。

2 结果与分析

2.1 耐铝甜瓜枯萎病细菌的分离筛选及拮抗指数、遗传稳定性、相对防效的测定

从甜瓜根际土壤中分离到一株耐铝甜瓜枯萎病拮抗菌，命名为A2。菌株与病原菌平板对峙效果见图1。结果表明，病原菌向拮抗菌株生长到一定程度即停止生长，有明显的抑菌带出现，病原菌菌丝发黑。

A：对照病原菌；B：平板对峙效果。

A： Fusarium oxysporum FJAT-9230； B： the result of pair culture.

菌株A2初代拮抗指数为2.03±0.14，转接至20代时，仍对甜瓜枯萎病病原菌有明显的拮抗效果，拮抗指数为1.87±0.22，与初代培养相比无明显差别。说明菌株对病原菌的拮抗效果持久有效，有较好的遗传稳定性。

对病原菌的防效结果见表1。由表1可知，施用A2菌液处理后，病情指数明显低于清水对照，表明菌株A2对甜瓜枯萎病病原菌具有良好防效（68.3%），与多菌灵处理的防治效果（72.1%）相当。

2.2 菌株形态观察、生理生化特征的确定及分类地位分析

对菌株A2的菌落及菌体形态进行观察，结果表明，在S-LB平板上，菌株A2的菌落呈圆形，乳白色，光滑（图2-A）；在透射显微镜下观察，该菌为杆状，有极生鞭毛，无芽孢（图2-B）。

A： 菌株A2菌落形态照片； B： 菌株A2透射电镜照片。

生理生化特征测定结果表明，该菌为革兰氏阴性菌，可利用D-葡萄糖、D-甘露糖醇、L-阿拉伯糖、肌醇为碳源生长，硝酸盐还原试验、过氧化氢酶、细胞色素氧化酶试验为阳性，吲哚产生试验为阴性。

菌株A2的16S rRNA基因系统发育树见图3。结果表明菌株A2与假单胞菌属（Pseudomonas sp.）有较高的同源性，在系统发育树上与Pseudomonas paralactis WS4992 的16S rRNA基因相似性最高，为99.44%，与Pseudomonas antarctica CMS 35 的16S rRNA基因相似性最低，为98.35 %；并且和Pseudomonas lactis、Pseudomonas azotoformans聚类在一个亚分支上。结合其生理生化特征及16S rRNA基因序列分析结果，将菌株A2鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。

2.3 不同形态Al3+对菌株生长的影响

由于各种Al3+形态在水中的溶解度不同，本研究选取溶解度较好的AlCl3、Al2（SO4）3中2种形态的Al3+作为代表，研究其对菌株A2生长的影响，结果如图4。结果表明，2种形态的Al3+浓度为30 mmol/L时，与不加Al3+的对照相比，菌株A2的生长受到一定抑制；但相比AlCl3处理，在Al2（SO4）3处理中，菌株A2进入对数期的时间较早，且生长速率较快，菌株A2对Al2（SO4）3表现出了更好的耐受性。因此选取Al2（SO4）3中的Al3+作为后续的处理形态。

2.4 菌株耐铝能力分析

通过观察不同浓度的A2菌液在不同Al3+浓度S-LB培养基中的生长情况，对菌株A2的耐铝能力进行初步分析，结果见表2。

结果表明，Al3+浓度为10 mmol/L时，不耐铝的对照菌株已停止生长，但菌株A2的生长并未受到抑制，与不加Al3+的处理相比，没有明显的区别。随着Al3+浓度增大，菌株的生长逐渐受到抑制。当Al3+浓度为50 mmol/L时，菌液稀释100倍点接的菌株A2已停止生长，菌液未稀释的和稀释10倍点接的菌株A2仍然可以生长，但与不加Al3+和低浓度Al3+处理相比，生长受到明显抑制，说明50 mmol/LAl3+已对菌株A2产生毒性。综上所述，细菌A2可耐受50 mmol/L的Al3+，具有良好的耐铝能力。

2.5 pH值对菌株在Al3+中生长的影响

当pH值小于5时，活性铝主要以A13+形式存在，而当pH值超过6.0时，铝离子易生成氢氧化铝，出现絮状沉淀，所以研究pH≤5.0时，菌株A2在Al3+中的生长情况。结果见图5。结果表明，A13+存在条件下，pH值的变化对菌株生长有显著影响。pH值降低至4.0以下、Al3+浓度为30 mmol/L时，菌株的生长完全受到抑制。菌株在不加A13+的各个pH培养基中的OD600均大于有A13+的相应处理的数值。在无A13+条件下，菌株可在pH 3.0的S-LB培养基中生长，可见，酸性条件会显著加剧A13+对菌株A2的毒害作用。

同pH环境不同小写字母表明不同处理在0.05水平上存在显著差异。

Different lower-case letters in the same pH condition indicated significant differences at the 0.05 level.

2.6 温度对菌株在Al3+中生长的影响

温度对菌株A2在Al3+中生长的影响见图6。结果表明，A13+存在条件下，菌株在25～35 ℃条件下生长情况较好，在20～25 ℃和35～40 ℃范围内OD600值较小，当温度达到40 ℃时，菌株生长几乎停止。菌株A2最适生长温度为30 ℃。

2.7 阳离子对菌株生长的影响

研究同等正电荷量的不同阳离子对菌株A2生长的影响，结果见图7。结果表明，与不加任何阳离子处理的空白对照相比，同等电荷量的Na+、K+、Mg2+并未对菌株A2生长产生抑制，而高浓度A13+显著抑制了菌株生长。这表明A13+对菌株A2产生细胞毒性，主要原因并不是离子强度过高致使细胞质浓度降低、渗透势升高，细胞渗透调节失败。

3 讨论

在A13+易于对生物产生毒性、耐铝细菌难以筛选[24]、细菌的耐铝机制研究进展缓慢的前提下，本研究筛选到了一株耐铝细菌A2。以分子操作相对简单但研究成果较少的细菌，进行耐受性相关的基因组学和蛋白质组学研究，将成为今后揭示生物耐铝机制的重要手段。菌株A2可作为研究耐铝机制的良好对象。

甜瓜枯萎病主要利用生物手段防治，但拮抗菌因不具有耐铝特性，定殖能力低，无法在铝毒土壤中起作用；而甜瓜根际土壤中分离得到的耐铝甜瓜枯萎病拮抗菌，可能对甜瓜耐铝具有重要作用。综上所述，同时具有高效耐铝及防治甜瓜枯萎病两种功能的菌株A2，作为研究材料具有唯一性，可能在铝毒土壤中具有较高的定殖能力，能够更好的应用于铝毒严重的酸性土壤中的甜瓜枯萎病的生物防治。菌株A2进行连续传代后，仍能保持较高的拮抗指数，其拮抗能力的遗传稳定性有利于菌株在较长时间内对甜瓜枯萎病病原菌FJAT-9230起到抑制作用。研究结果表明，菌株A2可延迟发病时间，延缓病害发展速度。

王超等[23]研究发现，红酵母RS1对Al2（SO4）3 的忍耐能力高于AlCl3。本研究考察了Al3+形态对革兰氏阴性细菌A2生长的影响，结果表明菌株A2亦对Al2（SO4）3表现出了更好的耐受性，Al3+形态对菌株生长有显著影响。耐铝能力测定结果表明，菌株A2对A13+并无依赖性，较低浓度的A13+并不能促进菌株的生长。本研究中还发现，培养基初始pH下降会加剧A13+对菌株A2的毒害作用，与Al3+存在着叠加效应。引起上述现象的原因，可能与菌株耐铝的分子机制有关，仍需进一步研究。

本研究分离筛选到1株耐铝甜瓜枯萎病拮抗菌，命名为A2 ，经鉴定其为Pseudomonas sp.，A2最高可耐受50 mmol/LAl3+。对菌株A2防效及其拮抗能力的遗传稳定性、耐铝特性进行了研究。研究结果可为铝毒严重的酸性土壤中的甜瓜枯萎病的生物防治提供优质菌株资源和理论依据。

参 考 文 献

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