11种植物提取物对4种病原细菌的抑菌活性筛选

谢娜 李超 冯俊涛 张兴

摘 要 采用琼脂扩散法初步测试11种植物提取物对魔芋软腐病菌（Erwinia carotovora pv. carotovora）、猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）、白菜软腐病菌（Erwinia carotorora）、核桃细菌性黑斑病菌（Xanthomonas campestris pv.juglandis）4种病原细菌的抑制活性，进一步采用二倍稀释法测定高抑菌活性物质的最低抑菌浓度（MIC），旨在为植物源杀细菌剂的研发提供线索。测定结果表明，1 000 μg/mL剂量下，大黄、博落回和狼毒提取物对魔芋软腐病菌具有较强抑制活性，对猕猴桃溃疡病菌抑制作用最好的是博落回和大黄提取物，对核桃黑斑抑菌效果最好的是蛇床提取物，均优于或相当于农用链霉素200 μg/mL的效果；二倍稀释法测试表明，大黄和博落回提取物对魔芋软腐病菌的MIC值分别为7.8、15.6 μg/mL；大黄和博落回提取物对猕猴桃溃疡病菌的MIC值分别为3.9、15.6 μg/mL。说明大黄、博落回和狼毒提取物均具有显著抑制植物病原细菌的活性，有开发为新型植物源杀细菌剂的潜力。

关键词 植物病原细菌；活性筛选；大黄素；血根碱；狼毒素

中图分类号 S432.4+2 文献标识码 A

Screening of Antibacterial Activities of 11 Plant Extracts Against Four Pathogenic Bacteria

XIE Na1， LI Chao1， FENG Juntao1，2*， ZHANG Xing1，2

1 Research and Development Center of Biorational Pesticides， Northwest A & F University， Yangling， Shaanxi 712100， China

2 Engineering and Research Center of Biological Pesticide of Shaanxi Province， Yangling， Shaanxi 712100， China

Abstract The study measured the antibacterial activity of 11 plant extracts on four bacterial pathogens like Erwinia carotovora pv. carotovora， Pseudomonas syringae pv. actinidiae， Erwinia carotorora， and Xanthomonas campestris pv.juglandis to provide clues for the development of new bactericides by agar diffusion method. Double broth dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration （MIC）. The results obtained by the agar diffusion method showed that the extracts of sanguinarine， emodin and chamaejasmine had a relatively good inhibitory effect on E. carotovora pv. carotovora， and the extracts of emodin and chamaejasmine revealed a notable inhibitory effect on P. syringae pv. actinidiae， and the osthole extract could inhibit X. campestris pv. juglandis effectively， at the concentration of 1 000 μg/mL， and the effect was superior or comparable to streptomycin at 200 μg/mL. Results of the determination of MIC displayed that MIC value of the extract of emodin and sanguinarine on E. carotovora pv. carotovora was 7.8 μg/mL and 15.6 μg/mL. The MIC value of the extract of emodin and chamaejasmine on P. syringae pv. actinidiae was 3.9 μg/mL and 15.6 μg/mL. The extracts of sanguinarine， emodin and chamaejasmine had an apparent antibacterial activity， which could be developed as new botanical bactericides.

Key words plant pathogenic bacteria； screening； emodin； sanguinarine； chamaejasmine

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.019

植物源杀菌剂具有选择性高、环境友好、对非靶标生物安全、低毒、低残留等优点，从植物中寻找抑菌活性物质， 是研发新型杀菌剂的热点之一。目前，中国开发与应用的植物源杀菌剂主要有苦参碱、黄岑苷、小檗碱、丁子香酚、香芹酚、儿茶素、大蒜素、乙蒜素、大黄素甲醚等[1-3]。但前述产品多集中于对植物真菌病害的防治，对植物源杀细菌剂的研究大多侧重于食品污染菌的控制，且大多数还处于室内筛选阶段。魏希颖等[4]研究发现泡桐花提取液对金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用。叶舟[5]测定了木麻黄（Casuarina equisetifolia Forst）小枝提取液的抑菌活性，发现对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌表现出较强的抑制活性。崔彦等[6]的研究证明五倍子、丁香、地榆对黄瓜细菌角斑病菌表现出显著的抑制作用，其中五倍子提取物的活體防效可达60%，具有一定的开发潜力。李玉玲[7]发现竹焦油对甘蓝黑腐病菌、番茄细菌性斑点病菌、茄青枯病菌等多种供试细菌都有不同程度的抑制活性。为了获得对植物细菌病害有广泛抑菌谱的植物源物质，本研究选取已报道过的具有广泛抑菌活性的11种植物提取物，对魔芋软腐病菌、猕猴桃溃疡病菌、核桃黑斑病菌、白菜软腐病菌4种常见的病原细菌进行室内抑菌活性筛选，旨在为新型植物源杀细菌剂的开发研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 魔芋软腐病菌（Erwinia carotovora pv. carotovora）、猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）、白菜软腐病菌（Erwinia carotorora）均由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供；核桃细菌性黑斑病菌（Xanthomonas campestris pv. juglandis）由西北农林科技大学林学院提供。

1.1.2 供试植物源物质及试剂 大黄提取物（其中大黄素含量为0.30%）、博落回提取物（其中血根碱含量为0.57%）、狼毒提取物（其中狼毒素含量为1.90%）、皂荚提取物（其中皂荚素含量为6.90%）、苦参提取物（其中苦参碱含量为2.15%）均由山西德威生化有限公司提供。90%的小檗碱、蛇床提取物（其中蛇床子素的含量为10%）、藜芦生物碱（其中藜芦胺含量为2.30%）、98%的肉桂酸、98%的丁香酚、98%的柠檬酸铜均由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。72%的农用链霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。丙酮、葡萄糖、琼脂粉、氯化纳、胰蛋白胨、酒精、牛肉膏、酵母粉均购于陕西天成化玻有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制方法 室内生测用于细菌性病原菌的培养与保存的固体培养基（NA）：称取琼脂粉15 g、

蛋白胨5 g、牛肉膏3 g，加水至1 L，灭菌锅灭菌待用；用于活化细菌性病原菌菌株的液体培养液（LB）：称取胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠3 g，加水至1 L，灭菌锅灭菌待用。

1.2.2 药剂配制 采用对供试病菌没有抑菌作用的丙酮作为溶剂，将供试植物源物质溶解。用20%丙酮-水溶液将各植物源提取物或化合物按其有效成分含量溶解稀释成2 000 μg/mL药液（作为母液备用）。用无菌水将各母液分别依次2倍稀释最终确定为1 000、500、250 、125、62.5 μg/mL 5个浓度梯度处理，均以浓度为200 μg/mL的72%农用链霉素作药剂对照，采用对供试细菌没有抑菌作用的20%丙酮-水溶液作为空白对照，每个处理重复3次，以减少误差。

1.2.3 供试菌种的准备 将供试菌种在试验前1 d转接到LB培养液中，置于28 ℃恒温摇床箱中活化12 h。用无菌水调配成菌液浓度为1×106 CFU/mL，以供室内抑菌活性筛选使用。

1.2.4 琼脂扩散法室内抑菌活性筛选方法 采用琼脂扩散法进行室内抑菌活性筛选[8]，将溶化的营养琼脂培养基冷却至45～50 ℃，加入活化好的细菌数量大于106 CFU/mL的供试菌悬液摇匀（成带菌培养基）。每次取15 mL的带菌培养基，分别倒入直径为9 cm的玻璃培养皿中，制成带菌平板。待冷却后用直径为9 mm的打孔器在平板上均匀打3个孔，并用接种针挑出孔中培养基，在每孔内加入75 μL配好的供试植物源物质，以200 μg/mL的农用链霉素作为药剂对照，并以丙酮作为溶剂对照，每组处理重复3次。置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h后观察结果，用直尺按十字交叉法测量抑菌圈直径（减去孔径9 mm）求取平均值，进行比较。

1.2.5 最低有效抑制浓度（MIC）的测定方法 采用二倍稀释法测定待测植物源物质的MIC值[9]，取编号为1～11的试管以及适量的蒸馏水，放入灭菌锅里灭菌待用。灭菌完成后，取无菌试管，分别往试管内加入2 mL无菌水。将2 mL浓度为2 000 μg/mL待测药液加入1号试管中，摇匀后，将混合后的药液2 mL加入2号试管中，依次操作到10號管为止，弃掉10号管中的2 mL药液，使各个试管中的药液体积一样，将11号管设为空白对照，加入同等含量丙酮的水溶液。每种病菌设3组重复处理。最后将稀释好的细菌数量达104 CFU/mL的病原菌菌悬液2 mL分别加入1～11号试管中，置于适宜的温度培养箱中培养，待空白对照试管菌液出现浑浊，观察结果，进行比较。结果判断：由于菌液与药液等量混合，相当于将药液二倍稀释，最终待测药液为10个浓度梯度，分别为500、250、125、62.5、31.3、15.6 、7.8、3.9、1.8、0.9 μg/mL。

结果观察：通过肉眼比对发现试管内液体澄清透明经震荡后仍无沉淀产生，则此试管对应的药液浓度即为此药剂对待测病菌的MIC值。

1.3 数据分析

利用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 11种植物提取物对4种病原细菌的室内抑菌活性筛选

2.1.1 魔芋软腐病菌的室内抑菌活性筛选 采用琼脂扩散法测定了11种植物提取物对魔芋软腐病菌的抑制活性，结果表明，供试11种植物提取物对魔芋软腐病菌的抑制效果有明显的差异。大黄、狼毒、博落回提取物、小檗碱、肉桂酸和藜芦生物碱6种植物提取物对魔芋软腐病菌均有不同程度的抑制作用（表1），皂荚、苦参、蛇床提取物及丁香酚、柠檬酸铜对魔芋软腐病菌则无明显抑制效果。由表1可看出，博落回提取物对魔芋软腐病菌的抑制作用最强，浓度在1 000 μg/mL时，抑菌圈直径最高达（19.3±0.30） mm；其次是大黄、狼毒提取物，抑菌圈直径分别为（17.3±0.48）、（11.9±0.26） mm，均高于或相当于对照药剂农用链霉素200 μg/mL的抑菌圈直径（12.6±0.26） mm；同时，小檗碱、藜芦生物碱的抑菌圈直径也达到了（10.0±0.26）、（10.1±0.34） mm，对魔芋软腐病抑制作用较好；肉桂酸仅有微弱抑菌活性，其1 000 ?g/mL处理抑菌直径仅（0.3±0.10） mm。

2.1.2 猕猴桃溃疡病菌的室内抑菌活性筛选 通过对猕猴桃溃疡病菌的室内活性筛选结果表明（表2），在浓度为1 000 μg/mL时，大黄和狼毒提取物抑菌圈直径分别为（13.3±0.47）、（12.2±0.32） mm，均大于对照药剂农用链霉素浓度在200 μg/mL时的抑菌圈直径（12.0±0.18） mm；博落回、皂荚、苦参、蛇床提取物对病原菌抑制作用次之，最大抑菌圈直径在6.7～9.8 mm之间；柠檬酸铜的最大抑菌圈直径为（0.2±0.00） mm，抑菌作用较弱；小檗碱、丁香酚、肉桂酸以及藜芦生物碱则无明显抑制效果，故在表2中未列出。

2.1.3 核桃黑斑病菌的室内抑菌活性筛选 从表3结果可看出，蛇床子提取物对核桃黑斑病菌的抑菌作用最好，在浓度为1 000 ?g/mL时，抑菌直径达到（12.7±0.13）mm，其次是苦参提取物，抑菌圈直径为（10.0±0.23）mm。皂荚提取物、丁香酚、肉桂酸对核桃黑斑病菌也有一定的抑制作用。大黄、博落回、狼毒提取物、小檗碱、柠檬酸铜以及藜芦生物碱对核桃黑斑病菌无抑制作用，在表3中未列出。而药剂对照链霉素在200 ?g/mL时抑菌圈直径达（17.0±0.58）mm。由此表明，这11种植物提取物对核桃黑斑病菌抑制作用不显著。

2.1.4 白菜软腐病菌的室内抑菌活性筛选 试验结果（表4）表明，在11种供试植物提取物中，仅苦参提取物、丁香酚和肉桂酸对白菜软腐病菌有抑菌作用，而大黄、博落回、狼毒、蛇床子提取物、小檗碱、柠檬酸铜、藜芦生物碱及皂荚提取物对白菜软腐病菌无明显抑制作用，在表4的抑菌活性筛选的结果中未列出；苦参提取物、丁香酚和肉桂酸对白菜软腐菌均有一定的抑制作用但不显著，其最大的抑菌圈直径均比对照药剂农用链霉素在200 ?g/mL时的抑菌圈直径小。

2.2 抑菌活性较好的植物源物质的MIC测定结果

2.2.1 5种植物提取物对魔芋软腐病菌的MIC测定结果 由表5可知，大黄和博落回提取物对魔芋软腐病菌的MIC值分别为7.8、15.6 ?g/mL，均显著低于对照农用链霉素的MIC值31.3 ?g/mL。狼毒提取物、小檗碱和藜芦生物碱的MIC值分别为125、62.5、250 ?g/mL，表现出一定的抑菌活性，与表1的抑菌圈试验结果基本一致。综合表1和表5可知，大黄和博落回提取物对魔芋软腐病菌的抑菌作用最为显著，有进一步研究的潜力。同等含量丙酮的水溶液对魔芋软腐病菌的MIC值无影响。

2.2.2 6种植物提取物对猕猴桃溃疡病菌的MIC测定结果 从表6可知，大黄提取物对猕猴桃溃疡病菌的MIC值与对照农用链霉素均为3.9 ?g/mL，表明猕猴桃溃疡病菌对大黄提取物比较敏感。其次苦参和狼毒提取物的MIC值均达到15.6 ?g/mL，皂荚和博落回提取物分别为31.3、 250 ?g/mL，与表3的抑菌活性筛选结果基本相同。结合表5～6可看出，大黄、博落回和狼毒提取物对魔芋软腐病菌和猕猴桃溃疡病菌均有显著的抑制作用，表现出广谱的抑菌活性。同等含量丙酮的水溶液对猕猴桃溃疡病菌的MIC值无影响。

2.2.3 3种植物提取物对核桃黑斑病菌的MIC测定结果 由表7可见，核桃黑斑病菌对农用链霉素最敏感，其MIC值为7.8 ?g/mL。皂荚、苦参和蛇床子、提取物的MIC值分别为15.6、31.3、15.6 ?g/mL，也表现出较好的抑菌活性。同等含量丙酮的水溶液对核桃黑斑病菌的MIC值无影响。

3 讨论

本研究采用琼脂扩散法、二倍稀释法对11种植物提取物对魔芋软腐病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃细菌性黑斑病菌4种病原细菌的抑菌活性进行了研究。结果表明大黄、博落回和狼毒提取物均具有显著抑制植物病原细菌的活性，有开发为新型植物源杀细菌剂的潜力。其中，大黄提取物对魔芋软腐病菌和猕猴桃溃疡病菌的抑制效果最为突出；博落回提取物对魔芋软腐病菌、狼毒提取物对猕猴桃溃疡病菌、蛇床提取物对核桃黑斑病菌的MIC均在20 ?g/mL以下，与相应的对照药剂农用链霉素的MIC值相当，有显著的抑菌活性。苦参、蛇床子和皂荚提取物對特定病菌有良好的抑制活性，在杀细菌应用上有研究的价值。

狼毒、大黄和博落回提取物在抗细菌作用方面的研究甚少，且多集中于医药、食品研究。前人的=研究表明，狼毒石油醚提取物的杀烟蚜活性最好[10]；瑞香狼毒提取物对小菜蛾、枸杞蚜虫有十分显著的毒杀活性[11-12]。南苹瑶等[13]发现大黄乙醇提取物对大肠埃希菌ATCC25922的体外抑菌作用明显。Hazni等[14]研究结果显示，大黄素对金黄色葡萄球菌、溶血溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等都有较强的抑制作用；李文娟[15]研究证明瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最显著，其最低抑菌浓度和最低杀菌浓度为0.63 mg/mL；郁建平[16-17]研究发现盐酸血根碱具有很强的广谱抑菌作用，对木霉、根霉、黄曲霉、黑曲霉、米曲霉、毛霉、酵母的最低抑菌浓度均低于40 ?g/mL。杨军辉等[18]发现牛角瓜根的石油醚粗提物对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌和大肠埃希氏菌都表现出良好的抑菌活性。由此可见，狼毒、大黄和博落回提取物对多种细菌、真菌及农业害虫均具灭杀效果，尤其是其在农业方面的抗植物病原细菌作用更值得进一步深入研究。

供试11种植物源物质对白菜软腐病菌的抑制作用都不显著，应该适当增大筛选范围，以期得到对白菜软腐病菌有良好抑制作用的植物源物质。另外，本研究筛选得到的大黄、博落回和狼毒提取物等为植物粗提物，且仅进行了室内离体测试，而未进行活体试验以及田间试验，因而其主要抑菌活性成分及其在活体植物上的杀细菌活性均有待于进一步研究和探讨。

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