蝉花菌种的分离·鉴定及蝉花营养成分测定

邢康康 石萍 贺宗毅

摘要[目的]研究蝉花菌种的分离、鉴定及蝉花营养成分测定。[方法]对从重庆梁平地区采集得到的蝉花进行菌种分离和鉴定，并对蝉花的营养成分进行测定。[结果]分离菌株为蝉拟青霉菌（Paecilomyces cicadae），蝉花含有粗多糖、腺苷、甘露醇、氨基酸等营养成分。[结论]该研究为重庆梁平地区蝉花资源的开发利用提供参考，对扩大传统中药资源、进一步深入研究该菌株的药理作用和人工栽培技术具有重要意义。

关键词蝉花;分离鉴定;系统发育分析;营养成分

中图分类号R284文献标识码

A文章编号0517-6611（2018）28-0162-02

Separation and Identification of the Strain from Cordyceps cicadae and Determination of the Nutrient Content of Cordyceps cicadae

XING Kangkang，SHI Ping，HE Zongyi et al（1.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica， Chongqing 400065;2.Chongqing Sericulture Science and Technology Research Institute， Chongqing 400700）

Abstract[Objective] The research aimed to study the the isolation， identification of the strain from Cordyceps cicadae and determination of the nutrient content of Cordyceps cicadae.[Method]The Cordyceps cicadae strains collected from the Liangping area in Chongqing were isolated and identified， and the nutrient content of Cordyceps cicadae were determined.[Result]The isolated strain was Paecilomyces cicadae and Cordyceps cicadae contained many nutrient contents such as crude polysaccharide， adenosine， mannitol， amino acids and so on.[Conclusion]This study provides reference for the development and utilization of Cordyceps cicadae resources in Liangping area of Chongqing. The results are of great significance for expanding traditional Chinese medicine resources and further researching the pharmacological effects and artificial cultivation techniques of the strain.

Key wordsCordyceps cicadae;Isolation and identification;Phylogenetic analysis;Nutrient content

蝉花俗称蝉虫草、蝉茸、胡蝉等，是蝉拟青霉 （Paecilomyces cicadae） 等麦角菌科（Claviceptaceae）真菌寄生于一些蝉若虫后形成的菌虫复合体[1]。《图经本草》记载：“今蜀中有一种蝉，其蜕壳头上有一角，如花冠状，谓之蝉花。”《本草纲目》记载：“蝉花可治疗惊痫，夜啼心悸，功同蝉蜕”。现代研究表明，蝉花中含有糖原、甘露醇、多种生物碱、蛋白质、多种氨基酸以及多种微量元素等化学成分，且糖类和蛋白质的含量相对较高[2]，具有免疫调节、代谢调节、解热镇痛、镇静催眠、改善肾功能、降血糖、抗肿瘤等药理作用。

蝉棒束孢的寄主广泛，常见的有竹蝉（Platylomia pieli）、山蝉 （Cicada flammata）、蟪蛄 （Platyleura kaempferi）、云南黑蟬 （Cicadatra shaluensis）、草蝉（Mogannia conica）、小鸣蝉 （Oncotympana ella）和透翅蝉 （Hyalessa roils），多分布在我国南方诸省[3]。不同地区不同生境采集的蝉花分离物，极具物种多样性，它们之间在形态和遗传上具有明显的差异，且不同菌株的药理作用及生物活性含量差异明显[4]。笔者对重庆梁平地区野生蝉花菌种进行分离、鉴定，并对蝉花营养成分开展研究，有利于为当地蝉花资源的开发利用提供参考，对扩大传统中药资源、进一步深入研究该菌株的药理作用和人工栽培技术具有重要意义。

1材料与方法

1.1材料蝉花于2017年7月采集于重庆梁平，编号CCS01。

1.2培养基PDA固体培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 L，pH自然。121 ℃灭菌20 min。

1.3蝉花真菌的分离、纯化

1.3.1虫体分离法。取新鲜蝉花，75%乙醇消毒，选取虫体胸足为界的前段部分，用镊子撕开表皮，取胸腔中菌体少许，接入分离培养基，于25 ℃培养。待菌落长至0.2～0.5 cm时，挑选少量菌丝在分离培养基上纯化2～4次，确定无杂菌后移入试管培养保存。

1.3.2子座分离法。取新鲜蝉花，从僵虫头顶切下子座芽，75%乙醇消毒，用镊子撕开表皮，切取中间部位组织块接入培养基，置25 ℃培养。待菌落长至0.2～0.5 cm时，挑选少量菌丝在分离培养基上纯化2～4次，确定无杂菌后移入试管培养保存。

1.3.3孢子分离法。取新鲜蝉花，从僵虫头顶切下子座芽，75%乙醇消毒，用无菌棉包裹子座基部倒置于斜面试管口，让孢子自然弹落到分离培养基上，置25 ℃培养。待菌落长至0.2～0.5 cm时，挑选少量菌丝在分离培养基上纯化2～4次，确定无杂菌后移入试管培养保存。

1.4蝉花真菌的鉴定

1.4.1形态鉴定。

挑取蝉花菌种接种到PDA培养基上，25 ℃培养3～5 d，观察菌落形态。

1.4.2ITS分子鉴定。

将野生蝉花样品风干后抽提DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA抽提结果。设计ITS序列引物，将抽提的DNA进行PCR扩增。产物纯化后琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。获得的序列经BLAST比对，结合形态学特征，确定分离菌株的分类地位。

1.4.3DNA序列分析及系统发育树构建。

将测序获得的ITS序列通过BLAST比对，根据同源性相似度差异，利用Clustal X（Version 1.83）软件进行多序列匹配排列，用软件MAFFT version 7邻接法（Neighbour-Joining，NJ）构建系统发育树，对分离菌株与Genebank数据库中登录的近源菌株系统发育关系进行分析。

1.5蝉花的营养成分分析

1.5.1氨基酸含量分析。

根据《食品安全国家标准》GB 5009.124—2016，采用氨基酸分析仪（茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪）测定蝉花中的氨基酸。

1.5.2粗多糖含量测定。

按照《保健食品功效成分检测方法》将蝉花中多糖成分经乙醇沉淀分离后，加酸、加热、回流水解成单糖，以次甲基蓝作为指示剂，在加热条件下，滴定经标定过的碱性酒石酸钾钠铜溶液，根据样品液消耗体积，计算其含量。

1.5.3腺苷及甘露醇含量测定。

根据《保健食品检验与评价技术规范》2003版规定，蝉花中腺苷用超声波提取后采用液相色谱测定含量。按照《中华人民共和国药典》2015版一部，采用高效液相色谱法测定甘露醇含量。

2结果与分析

2.1菌株鉴定 在PDA平板上形成的菌落为圆形，表面蓬松，菌丝初始为白色，继续培养呈淡黄色。星状放射生长、菌丝平伏，与培养基结合紧密，不易挑取。经ITS区测序，BLAST比对，综合鉴定结果为蝉拟青霉。

2.2分子系统学分析

根据蝉花分离菌株CCS01系统进化树（图1），分离菌株CCS01的ITS序列与蝉花 （Cordyceps cicadae） KY924492菌株、蛇腹虫草 （Ophiocordyceps sobolifera） JQ283963菌株、细脚棒束孢 （Isaria tenuipes） MG833296菌株、炭角棒束孢 （Isaria xylariiformis） FJ479746菌株、双节棍孢子植生虫草 （Phytocordyceps ninchukispora） EF411226菌株的相似度均为100%;与大蝉草 （Ophiocordyceps sobolifera） JQ283963，茶色黏伞 （Limacella glioderma） FJ478086，蝉拟青霉 （Paecilomyces cicadae） HQ87463、AF368801、GU194182.1，下垂虫草（Cordyceps nutans） AJ536559，蛹虫草（Cordyceps takaomontana） KY075927 菌株序列的相似度为99%。结合Genebank上的12个虫草有关序列进行了系統发育树构建。分枝统计支持率评估采用Bootstrap法，自展值为1 000。由图1可知，所有序列形成2个大的分支，除蛹虫草 （Cordyceps takaomontana） KY075927菌株自成一支外，菌株CCS01和其余虫草相关真菌聚成一个大的进化分支。

2.3营养成分分析

根据蝉花营养成分测定结果（表1），从蝉花中共检测到16种氨基酸，总含量为22.26%。其中蛋氨酸和谷氨酸含量较高，分别为3.07%和2.09%。含有赖氨酸（1.29%）、亮氨酸（1.07%）、异亮氨酸（0.63%）、苯丙氨酸（0.75%）、蛋氨酸（3.07%）、苏氨酸（1.02%）、缬氨酸（0.87%）7种必需氨基酸，只有色氨酸未检测到。经测定，蝉花中粗多糖含量为0.61%，腺苷含量达到10.80 mg/kg，甘露醇的含量为5.13%。

3小结与讨论

该研究以重庆梁平蝉花CCS01为样品，从菌种分离、鉴定和营养成分测定三方面进行系统研究。试验结果表明，通过形态观察与ITS比对分析，该菌株综合鉴定结果为蝉拟青霉，其ITS序列长度为517 bp，与蝉花 （Cordyceps cicadae） KY924492菌株、蛇腹虫草 （Ophiocordyceps sobolifera） JQ283963菌株、细脚棒束孢 （Isaria tenuipes） MG833296菌株、炭角棒束孢 （Isaria xylariiformis） FJ479746菌株、双节棍孢子植生虫草 （Phytocordyceps ninchukispora） EF411226菌株的相似度均为100%。

多糖是蝉花的主要生物活性成分之一，具有显著的抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗衰老等药理活性[5]。测定梁平蝉花中粗多糖含量为0.61%，远低于广州地区蝉花（2.85%）[6]。腺苷具有降低血压、镇静、抗癫痫、催眠等生理功能，还有能量转移、信号传递、抑制脂肪分解等生理功能[7-8] 。梁平蝉花中腺苷含量达到10.80 mg/kg，与广西玉林蝉花含量（11.331 mg/kg）接近[9]。甘露醇作为一种渗透性脱水利尿剂，在临床中得到了广泛的应用，它具有脱水、清除氧自由基、降低血黏度、改善微循环等作用[10]。甘露醇的含量为5.13%，较杭州蝉花高（2.18%）[11];从蝉花中共检测到16种氨基酸，总含量为22.26%，远高于浙江湖州蝉花（9.61%）[12]。其中蛋氨酸和谷

氨酸含量較高，分别为3.07%和2.09%。含有除色氨酸以外所有的必需氨基酸。梁平蝉花各活性物质含量与其他地区蝉花相比具有明显的差异性，可能是由于蝉花菌种的差异性以及特异的环境影响所造成的，这与张传博等[4]不同菌种的药理作用及生物活性物质含量差异明显的观点一致。

梁平地区蝉花腺苷和甘露醇含量较高，氨基酸种类多样，具有较高的药理作用和营养价值，可以对其天然资源进行开发利用。此外，还可以充分挖掘蝉花资源的潜力和价值，如蝉花其他药理作用研究、蝉拟青霉菌株液体发酵生产生物活性物质研究、人工栽培蝉花研究等。

参考文献

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