昆明市呈贡区红火蚁入侵情况调查及生物防治方法研究

王伟伟 单慧 张艺夕 刘晶 唐唯

摘要 对红火蚁在呈贡区的入侵情况、形态特点及群体结构进行调查，并探索红火蚁的生物防治方法。2017年第一次调查有蚁堆157个，第6次调查增加到340个，增长率达116.56%；形态学观察及SSR基因多样性检测结果表明，呈贡区入侵红火蚁为同一个种，群体结构较为单一；生物防治测定发现黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride）和球孢白僵菌（Beauveria bassiana） 2个虫生真菌均有防治效果，在106个/mL孢子浓度下红火蚁致死率最高，处理第9天分别达50.7%和60.5%；2个真菌混合的孢子悬浮液，在106个/mL孢子浓度下，处理第9天的致死率达93.3%，致死中时（LT50=3.49）最短。

关键词 红火蚁；入侵；SSR；生物防治

中图分类号 S433文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）31-0149-05

Abstract This study investigated the invasion situation， morphologic characters and population structure of RIFA in Chenggong District， and developed the biological control methods with two fungus.The first investigation showed that 157 ant nests were found in 2017， but 340 nests were detected by the 6th investigation in same year， up to 116.56% increasing rate.Meanwhile， the results of SSR test and morphology observation showed that the low population diversity with a singlespecies in Chenggong in 2017.Biological control test using both Metarhizium flavoviride and Beauveria bassiana showed the toxic effects to RIFA， and the more higher fatality rate under the 106 spores/mL concentrations at the 9th day was up to 50.7% and 60.5%， respectively.The result also found the highest fatality rate under the mixture with each 106 spores/mL concentrations at the 9th day was up to 93.3%， median lethal time（LT50） equal to 3.49.

Key words The red imported fire ant；Invasion；SSR；Biological control

红火蚁（Solenopsis invicta，the red imported fire ant，RIFA）是一种原产于南美洲巴拉那河流域的害虫，被列为世界上最危险的100种入侵有害生物之一[1]。红火蚁在1986年传入美国，2001年传入澳洲大陆，2003年传入我国台湾地区，2004年底传入我国大陆，在广东吴川地区首次发现。我国于2005年1月将其列为入境检疫害虫[2]。目前，红火蚁在我国南方地区9个省的传播速度非常快[3-4]。

红火蚁为完全地栖型蚁巢的蚂蚁种类，成熟蚁巢是以土壤堆成蚁丘，有时为大面积蜂窝状，内部结构呈蜂窝状分布。新建的蚁丘表面土壤颗粒细碎、均匀，随着蚁巢内蚁群数量不断增加，露出土面的蚁丘也不断增大[5]。红火蚁具有2种社会模式[6]，因此，其繁殖速度非常快。红火蚁的入侵可极大地威胁地区的生物多样性，还可使土壤内氮和磷含量显著降低，严重影响植物的生长[7-8]。目前对红火蚁的防治以化学药剂为主，主要采用赐诺杀spinosyns、芬普fipronil、氟啶虫胺腈sulfoxaflor、百利普芬pyriproxyfen药剂[9-10]，一种或几种溶解在食用油中，与饼干或面包屑混在一起作为诱饵来毒杀蚁巢中的蚁后。但化学方法也存在一定缺陷，一是南方湿润多雨，诱饵在受潮后将部分或完全失效；二是化学药剂将长期残留在土壤深处，对生态环境造成持久影响。

生物防治是一项具有可持续性特点的防治手段，典型防治模式为蚤蝇，其具有强寄生性，目前被认为是红火蚁的天敌，某些线虫对蚁巢也有破坏作用[11]。此外，一些殺虫真菌也被用来防治红火蚁[12-13]。如用淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus） 菌株处理红火蚁15 d后，能杀死70.6%的工蚁[14]。研究表明，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride ）对红火蚁均有较好的防治效果[15-16]；球孢白僵苗和黄绿绿僵苗是虫生真菌，被认为是最有效的生物防治用真菌，其孢子和发酵液均能有效地防治红火蚁[17-19]。目前关于昆明呈贡地区红火蚁入侵群体结构和防治研究鲜见报道，同时，对2个生防虫生真菌混用的效果，也缺乏相应的研究。

昆明气候温和、湿润且多雨，适宜红火蚁生存繁殖[20]。呈贡区为昆明新区，绿化建设时引入大量外来苗木，因此红火蚁的入侵与外来苗木的带入密切相关。2014年首次在云南师范大学呈贡校区发现红火蚁，2015—2017年呈快速蔓延趋势。笔者研究2017年红火蚁入侵情况，对其分布和多样性特点进行分析，探讨球孢白僵菌和黄绿绿僵菌2种虫生真菌对红火蚁的生物防治效果。

1 材料与方法

1.1 调查地点及调查方法

红火蚁主要分布于呈贡区各高校校园草坪土壤内，从2017年4月15日至6月30日共分6次（14 d/次）对6所高校（云南师范大学、昆明理工大学、云南大学、昆明医科大学、云南民族大学、云南开放大学）校园内，直线距离间隔100 m以上的，单体面积大于10 m2人工草坪随机选取各30个地块进行调查，记录蚁穴分布、发生率、蚁穴密度，动态监测蚁穴的体积变化，局部破坏蚁丘后观察蚁巢的内部结构。

1.2 采样及形态学观察

参考林立丰等[21]对红火蚁形态特征及其鉴别方法的研究，分别取大小均一的工蚁置于150 mL灭菌锥形瓶中，用3%（M/V）乙醚密封处理90 s，待红火蚁被麻醉后，在光学显微镜下（10×）观察形态特征。

1.3 DNA提取

随机采集6个不同地块的红火蚁20～30头，参照昆虫DNA提取试剂盒（Insect DNA Kit， OMEGA Inc.）说明书进行。提取的DNA置于-20 ℃保存备用。

1.4 PCR扩增、毛细管电泳检测

PCR扩增：2对PCR引物序列见表 引物由北京华大基因科技有限公司合成，扩增体系：2xTaq PCR Master mix 12.5 μL，模板DNA 10～15 ng，26BS、16BAS、24bS和25bAS[22]引物各1 μL或Solll-F、Solll-R [23-24]引物各1 μL，用ddH2O补至终体积25 μL。PCR反应在ABI 9700（Applied Biosystems）中进行。

26BS、16BAS、24bS和25bAS引物扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，共35个循环；68 ℃延伸5 min，4 ℃终止反应。Solll-F和Solll-R引物扩增程序：92 ℃预变性2 min；92 ℃变性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃终止反应。

毛细管电泳分析于ABI 3500基因分析仪上进行，用ABI Data Collection软件收集片段分析数据。

毛细管电泳扫描数据用软件Gene Mapper v4.0分析。基因频率、遗传多样性系数用MVSP Ver 1.32软件计算。

1.5 生防菌的分离及鉴定

2015年8月从昆明市呈贡区马金铺镇葡萄园采集僵蚕体和土壤表面死亡的金龟子，直接挑取菌丝或孢子粉后接种在PDA培养基上，放于25 ℃恒温箱中培养，经纯化、形态学和ITS序列鉴定，最终得到一株球孢白僵菌（B.bassiana）和一株黄绿绿僵菌（M.flavoviride）。

1.6 生防效果测定 球孢白僵菌和黄是绿僵苗菌株都是虫生真菌，均对红火蚁有一定的致死性，因此用球孢白僵苗和黄是绿僵菌的孢子悬浮液和两者混合的孢子悬浮液对红火蚁进行毒性测定。

将球孢白僵苗和黄是绿僵菌菌株分别接种于PDA培养基上，在25 ℃、光照周期12 h/d（lx=2 000）的培养箱中，培养14 d，待菌落产孢后，用0.05%Tween80溶液洗脱孢子在离心管内，振荡后用双层滤纸过滤，分别稀释为终浓度104、105、106 个/mL的孢子悬浮液备用；同时，用球孢白僵苗和黄绿绿僵菌相同浓度的孢子悬浮液等体积混合成104、105、106 个/mL的混合液备用。

工蚁分别于2017年4月22日和5月8日随机采集，置于灭菌的300 mL锥形瓶内，同时放入蚁穴周围的新鲜土壤100 g、新鲜苹果果肉40 g以及适量浸水棉球，在室温条件下透气滤纸密封放置48 h，待红火蚁生存状态趋于稳定后，挑出大小相近的健康工蚁用于后续试验。

以10头工蚁为一组放入各浓度的孢子悬浮液中，浸泡10 s后取出，放入锥形瓶中继续培养；空白对照组用无菌水代替真菌孢子悬浮液。每个浓度每个处理重复3次，从浸泡结束72 h后开始记录死亡数，每48 h记录一次，直至处理9 d为止。整个试验重复2次。计算致死中时（LT50∶死亡率达到50%所需要的时间）。

2 结果与分析

2.1 红火蚁入侵情况

2017年4—6月，红火蚁的蚁穴数量增长较快（表2），在各校区各随机选取3个蚁穴进行动态测量，2017年4月15日开始第1次，分别在4月29日、5月15日、5月29日、6月15日和6月29日共进行6次测量，结果发现不同地块蚁穴大小随时间增加呈持续增大趋势（图1）。

2.2 形态学观察

红火蚁工蚁虫体铜棕色，腹部深棕色，体长3～6 mm，中躯与腹部间有2个明显结节；头部呈正方形或心形，触角10节，大颚有4个明显的小齿（图2 A）；胸部有3对足（图2 B、C）；腹柄分为2节，腹部末端有毒刺（图2 D）；卵未观察到，蛹呈白色，虫体柔软，不能移动（图2 E），蚁穴明显隆起形成土丘（图2 F）。

2.3 毛细管电泳及分析

毛细管电泳分析发现2对引物共扩增出4个等位基因位点，其中2个多态性等位基因位点。6个不同采集地的红火蚁群体遗传相似性系数为0.857，红火蚁群体遗传距离在0.143～0.227。這表明各校园内红火蚁群体具有一定的多样性，但群体结构间差异较小（表3、图3）。

2.4 生防菌的防治效果

分别用不同浓度的球孢白僵菌和黄绿绿僵菌孢子悬浮液处理红火蚁并观察其防治效果，结果表明，2个菌株均在106个/mL时对红火蚁的致死率最高，第9天时致死率分别为50.7%、60.5%，对照组为16.7%（表4， 图4 A、B）；在该浓度下黄绿绿僵菌 （LT50 = 9.06）、球孢白僵菌（LT50=7.20）均远小于对照组（LT50 = 30.61）。在低浓度处理下（104个/mL）黄绿绿僵菌（LT50=16.07）大于球孢白僵菌（LT50=13.36），在中浓度处理下（105个/mL）球孢白僵菌（LT50=10.31）小于黄绿绿僵菌（LT50=19.00）。2个菌株孢子悬浮液的混合试验结果表明，106个/mL孢子浓度对红火蚁的致死率最高，第3、5、7、9天死率均显著高于相同时间下2个菌株的单独处理（P<0.05），第9天的致死率达93.3%，致死中时LT50=3.49；在中浓度105个/mL和低浓度104个/mL处理下，致死中时LT50分别为5.69和8.07（图4 C）。

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