一种抗猪流行性腹泻的中药复方制剂的亚慢性毒性试验

洪伟鸣 徐懿 宋亮 陈海峰 吉光杰 左伟勇

摘要 [目的]为了观察一种抗猪流行性腹泻病的中药复方制剂的亚慢性毒性。[方法]根据《兽药试验技术规范汇编》中的亚慢性毒性试验技术要求；选用小白鼠进行了亚慢性毒性研究。[结果]试验组与空白对照组实验数据相比差异不显著（P>0.05），表明该复方制剂对小鼠血常规检查和血液生化指标检测没有造成任何不良影响。[结论]临床使用该复方制剂进行治疗安全可靠。

关键词 猪流行性腹泻；中药复方制剂；小鼠；亚慢性毒性

中图分类号 S858.28文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）31-0074-03

Key words [Objective] To study subchronic toxicity of one traditional Chinese medicine compound preparation against porcine epidemic diarrhea. [Method] According to the technical requirements of subchronic toxicity test in the Compilation of Technical Specifications for Veterinary Drug Testing， the subchronic toxicity of mice was studied. [Result] There was no significant difference（P<0.05） between data of the experimental group and the blank control group. The results showed that the compound preparation had no adverse effect on blood routine examination and blood biochemical index test in mice. [Conclusion] The traditional Chinese medicine compound preparation can be safely used for clinical application.

Key words Porcine epidemic diarrhea；Traditional Chinese medicine compound preparation；Mouse；Subchronic toxicity test

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的急性、接触性、高度传染性的一种消化道疾病，是危害养猪产业最重要的传染病之一。该病临床主要症状表现为急性肠炎以及呕吐、水样腹泻和脱水。PED的波及范围甚广，在全球均有病例报道。并且PED发病率高，各種年龄的猪都能感染发病，7日龄以下仔猪感染死亡率可高达80%～100%[1]。PED的频发给我国养猪产业造成了严重的经济损失[2]。

由于PEDV具有高度的变异性，给临床治疗带来了很多困难。目前市面上预防PED主要是依靠PED弱毒苗和灭活苗[3]。治疗PEDV的药物以西药为主，虽可缓解病情和降低死亡率，但极易引起致病病毒变异而导致产生耐药性，并存在动物体内药物残留等隐患[4]。因此，开展抗PEDV药物的研发对控制猪流行性腹泻病、促进养猪产业的健康发展有着十分重要的意义。随着市场上人们对绿色、安全畜产品的需求度越来越高，中药作为化学药物的替代品用于防治畜禽疾病愈发获得了大家的肯定。该研究所用药物为江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室研制的一种用于防治猪流行性腹泻病的纯中药复方制剂，为全面评价其安全性和为临床安全科学用药提供依据，根据农业部《兽药试验技术规范汇编》的技术要求[5]，进行了亚慢性毒性试验研究。同时，也为后续深入探讨该复方制剂在临床上的推广应用研究提供科学依据和支撑。

1 材料与方法

1.1 试验动物

清洁级昆明系小白鼠80只，雌雄各半，体重20±2g，购自江苏省扬州大学比较医学中心[动物生产许可证号：SYXK（苏）2015000003]。

1.2 试验药物

抗猪流行性腹泻的中药复方制剂由黄连、白头翁等10味中药精制而成，浓缩至1 mL药液相当于1 g药材。由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室自行研制。

1.3 仪器

全自动血液细胞分析仪（BC-5380，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；全自动生化分析仪（BS-420，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；光学显微镜（BX53，日本OLYMPUS公司）；电子天平（MS204S，梅特勒托利多公司）。

1.4 动物分组及处理

将小白鼠随机分成四组，即低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白对照组，每组20只，雌雄各半，进行适应性饲养后开展试验。根据预试验的剂量，低、中、高3个剂量组分别按0.01、0.02、0.04 mL/g 3个不同剂量给药，空白对照组按0.04 mL/g给予生理盐水。药物及生理盐水均事先拌于饲料中并烘干制作成型，任由实验动物采食，连续给药28 d。每天仔细观察小鼠的活动、采食、饮水、发病和死亡等情况，对小鼠进行空腹称重，计算增重，给药结束后对存活小鼠进行血常规和血液生化学指标检测，随后统一剖杀观察主要脏器是否存在病变或其他异常[5]。

1.5 检测项目

1.5.1 血常规检查 摘除小鼠眼球进行采血，利用全自动血液细胞分析仪测定红细胞数、白细胞数、血小板数、血红蛋白浓度、红细胞压积、血小板压积和淋巴细胞数。

1.5.2 血液生化学检测 采血分离出血清后利用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白、尿素氮、肌酐和血糖含量。

1.5.3 脏器系数及组织病理学检查 对存活小鼠进行统一剖检，测定心、肝、脾、肺、肾等脏器的绝对重量及脏器系数（脏器系数=脏器湿重/体重×100），同时选择性的对肝、肾、脾、胃肠等器官进行目检，记录异常或脏器病变情况。

1.6 数据统计分析

试验数据以平均数±标准差表示，采用SPSS13.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析及t检验，检验水准α=0.05。

2 结果与分析

2.1 临床表现

整个试验过程中3个给药组与空白对照组的小鼠均未出现死亡，采食和饮水均正常，活动自如，呈现健康状态。

2.2 体重变化情况

如表1所示，从第7天起至28天空白对照组小鼠体重均略低于3个试验组，但整个试验周期内各试验组与空白对照组相比小鼠体重差异均不显著（P>005），各试验组间体重比较也无显著差异（P>0.05），由此可说明该复方制剂对小鼠的体重影响甚微。

2.3 血常规检查情况

血常规检查结果显示如表2所示，空白对照组白细胞数略高于3个试验组，但统计结果分析差异不显著（P>0.05）。其余各个检测指标低、中、高3个剂量组与空白对照组相比差异均不显著（P>0.05）。由此可说明该复方制剂对小鼠血常规检查的各项指标未带来不良影响。

2.4 血液生化学检测情况

血液生化学检测结果如表3所示，结果显示空白对照组的总蛋白与血糖含量略低于3个试验组，但结果统计分析差异不显著（P>0.05）。其余各个检测指标各试验组测定结果与空白对照组测定结果相比差异均不显著（P>0.05），由此可说明该复方制剂对小鼠血液生化学检测指标未造成不良影响。

2.5 脏器系数

试验结束时统一剖杀小鼠测定心脏、肝脏、肾脏等主要脏器的绝对重量，测出脏器系数，结果见表4。从表中结果可见，3个试验组与空白对照组的脏器系数相比较差异均不显著（P>0.05）。各组的脏器系数均在正常值范围内，据此可说明该复方制剂对小鼠的主要脏器系数未造成不良影响。

2.6 组织病理学检查情况

随机挑选各试验组10只小鼠进行统一剖检，仔细观察该复方制剂有无对小鼠内脏器官的造成不良影响。观察后未见肝脏、肾脏、脾脏、胃和肠等器官组织的形态、颜色、质地出现异常，组织病理学检查亦未见脏器发生病理异常变化。由此可说明该复方制剂未对小鼠的内脏器官造成不良影响。

3 讨论

亚慢性毒性试验是评价新兽药一般毒性的重要内容，对后续临床安全合理用药甚为关键。试验研究结果表明，该复方制剂分别按0.01、0.02、0.04 mL/g等3个不同剂量进行连续给药28 d，研究结果表明3个试验组小鼠在整个试验周期内均生长正常，活动自如，体重变化、血常规检查、血液生化学检测、脏器系数、组织病理学检查与空白对照组相比均无显著差异（P>0.05）。有研究报道表明如若动物的肝功能或肾功能受到损伤，血液中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）或肌酐（CR）会显著升高[6-7]，而上述3个指标在该试验研究中均处于正常值范围内。

故可认为按临床推荐剂量使用该复方制剂治疗猪流行性腹泻病是安全可靠的，同时也为后续将该制剂开发为新兽药奠定了扎实的基础。

参考文献

[1] 高君恺，刘浩飞，杨倩.猪流行性腹泻病毒的研究进展[J].南京农业大学学报，2014，37（1）：1-5.

[2] CHEN J F，WANG C B，SHI H Y，et al.Molecular epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus in China[J].Arch Virol，2010，155（9）：1471-1476.

[3] 张冰，关增春，于晓娜，等.猪流行性腹泻预防及诊断研究进展[J].湖北畜牧兽医，2014，35（9）：84-86.

[4] 李彬，刘浩飞，孙冰，等.猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用[J].江苏农业学报，2014，30（1）：125-129.

[5] 農业部兽药审评委员会办公室.兽药试验技术规范汇编[S].北京：农业部兽药审评委员会办公室，2001.

[6] 洪伟鸣，左伟勇，宋亮，等.鸡支康口服液的亚慢性毒性试验研究[J].中国畜牧兽医，2013，40（9）：140-143.

[7] 王越，沈连忠，李波.临床前研究中肝损伤的临床病理指标的选择及意义[J].中国药事，2009，23（8）：813-816.

[8] 任丽，蒋素华，刘红，等.血肌酐水平、MDRD-GFR、CG-GFR与肾小管间质病变相关性研究[J].检验医学与临床，2010，7（22）：2436-2438.