产pseurotin A内生真菌GYP8的鉴定

姜硕 许哲祥 王宇晴等

摘要 [目的]研究甘草内生真菌GYP8活性代谢物，丰富pseurotin A植物内生真菌资源库。[方法] 利用HPLC法对GYP8发酵液进行分析；采用柱色谱分离法对GYP8 活性成分进行分离、纯化；采用形态特征观察法及18SrDNA 序列分析对内生真菌GYP8进行菌种鉴定。[结果]内生真菌GYP8发酵液中含有pseurotin A，经鉴定该菌为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。[结论] GYP8是pseurotin A产生菌，该菌的获得可为pseurotin A成分的生产提供新方法。

关键词 pseurotin A；内生真菌；鉴定

中图分类号 R931 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）32-0085-03

Identification of Pseurotin Aproducing Endophytic Fungus GYP8

JIANG Shuo1，2， XU Zhexiang1，2， WANG Yuqing1，2 et al

（1.Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology， Ministry of Education， Heilongjiang University， Harbin， Heilongjiang 150500；2.Key Laboratory of Microbiology， College of Heilongjiang Province， School of Life Sciences， Heilongjiang University， Harbin， Heilongjiang 150080）

Abstract [Objective]To study the active metabolites of endophytic fungi GYP8 from Glycyrrhiza uralensis and enrich the pseurotin A endophyte resource pool. [Method]The fermentation broth of GYP8 was analyzed by HPLC.The positive components of GYP8 were separated and purified by column chromatography.Strain identification of the endogenous fungi GYP8 was performed by morphological observation and 18SrDNA sequence analysis.[Result]Compound pseurotin A was isolated from the fermentation broth of GYP8 and endophytic fungus GYP8 was identified as Aspergillus fumigatus.[Conclusion] GYP8 is a pseurotin Aproducing endophytic fungus， which provides a new means for development and application of pseurotin A.

Key words Pseurotin A；Endophytic fungus；Identification

基金項目 黑龙江省自然科学基金项目（面上项目）（H2015003）。

作者简介 姜硕（1997—），女，黑龙江大庆人，硕士研究生，研究方向：微生物制药。*通讯作者，教授，博士，从事微生物制药研究。

收稿日期 2018-09-27

pseurotin A为重要的微生物次生代谢产物，是酰胺类生物碱[1]，也是重要的生化试剂，是阿朴吗啡拮抗剂，能抑制壳聚糖合成和单胺氧化酶活性，具有诱导细胞分化、抗菌和免疫调节作用，其主要生产渠道为从微生物代谢产物中分离得到[2]。

笔者在课题组前期研究的基础上，对具有潜在应用价值的乌拉尔甘草内生真菌GYP8发酵液进行分析检测，发现其发酵液中含有pseurotin A，该化合物首次从子囊菌（Pseudeurotium ovalis STORK）发酵液中分离得到[3]。随着对pseurotin A活性的深入研究，人们开始对pseurotin A及其类似物进行化学合成以提高产量，但化学合成生产pseurotin A具有环境污染、试剂消耗高、成本高等缺点，因此发掘新型高产pseurotin A菌株是目前研究的课题。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养

供试菌为内生真菌GYP8，分离自野生乌拉尔甘草叶（采集地为黑龙江省大庆地区）。PDA培养基同参考文献[4]。

1.2 仪器与试剂

FL2200高效液相色谱仪（浙江温岭）。

18SrDNA扩增通用引物NS1（5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3）和NS6（5-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3），由上海生工生物工程股份有限公司合成。

试剂：甲醇为色谱纯级别，其他试剂均为分析纯。

1.3 内生真菌GYP8发酵液制备

取已活化的甘草内生真菌GYP8接种于60 mL液体马铃薯培养基中（摇床培养28 ℃，140 r/min，3 d），制成1×107 CFU/mL种子培养液。取种子液以5%（V/V）的接种量转接至300 mL 液体马铃薯培养基中（摇床培养28 ℃，140 r/min，14 d），抽滤，滤液于50 ℃减压浓缩，作为发酵液供试品。

1.4 GYP8发酵液中活性成分分析与分离

1.4.1 GYP8发酵液中活性成分分析。

取“1.3”供试品，40 ℃真空减压抽干后，加入1 mL甲醇溶解，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取滤液作为供试品溶液。采用HPLC法，分别精密吸取 0.5 mg/mL 的pseurotin A对照品液及供试品液各 10 μL 注入HPLC仪器，HPLC检测条件为Venusil XBP-C18柱（柱4.6 mm×250 mm，5 μm，USA）；流動相为甲醇∶水∶甲酸（60∶40∶0.5）；流速1 mL/min；柱温25 ℃；检测波长254 nm。

1.4.2 GYP8发酵液中活性成分分离。

取“1.3”制备GYP8菌株发酵液10 L，50 ℃减压浓缩至200 mL，以乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），合并萃取液后减压浓缩，进行硅胶柱分离，以石油醚∶乙酸乙酯=15∶5为洗脱剂，用薄层鉴别（TLC）对其进行检测（GF254薄层板，石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸=15∶15∶2）（100 mm×200 mm），依据TLC检识结果，合并成分相似或相同的洗脱液；得粗晶体后二次硅胶柱层析，以石油醚∶乙酸乙酯=15∶15为洗脱剂，根据薄层鉴别结果合并洗脱液，回收溶剂，重结晶，得到化合物单体。

1.5 内生真菌GYP8的鉴定

1.5.1

内生真菌GYP8形态学鉴定。参考文献[5]方法进行。采用平板PDA培养基培养GYP8（28 ℃，7 d），观察形态特征；同时取同培养2 d的GYP8 PDA平板，将灭菌盖玻片倾斜插入该平板中，继续培养3 d，取出，取盖玻片，清除背面附着物，显微镜下观察GYP8菌株的孢子显微特征，初步确定菌株的分类地位[6]。

1.5.2

内生真菌GYP8 18SrDNA序列扩增及序列分析。参阅文献[7]方法进行。PCR 产物纯化后，测序工作委托上海生工生物工程股份有限公司完成。所测得序列提交GenBank 数据库，利用MEGA5.05构建系统发育树，确定GYP8菌株的分类地位。

2 结果与分析

2.1 GYP8发酵液中活性成分分离结果

2.1.1 GYP8发酵液中活性成分分析结果。按“1.4.1”HPLC分析，甘草内生真菌GYP8发酵液中可能含有pseurotin A，供试品色谱中，在与pseurotin A对照品相同保留时间位置上，有相同的色谱峰出现（图1），PDA空白培养基相应保留时间位置未见任何色谱峰出现。

2.1.2

GYP8发酵液中活性成分分离结果。按“1.4.2”分离方法所得为无色粉末状结晶。薄层鉴别结果显示，该晶体与pseurotin A对照品在相同位置显相同颜色斑点（图2）。MS鉴定结果为Positive MS：454.3[M+Na]+，885.4[2M+Na]+，Negetive MS：429.9[M-H]-，861.5[2M-H]-。1H-NMR（MeOD，400 MHz）δ：4.57（dd，J=6.4，8.8 Hz，H-11），5.36（dd，J=8.8，9.8 Hz，H-12），

2.2 内生真菌GYP8鉴定结果

2.2.1

内生真菌GYP8形态学鉴定结果。甘草内生真菌GYP8菌落翠绿色，边缘白色，产生翠绿色粉末，基质淡黄色（图4）；甘草内生真菌GYP8菌株的分生孢子呈穗圆筒形，颜色深浅不一，分生孢子梗绿色光滑无突起，顶囊向外突出呈现烧瓶状，且只有上半部产生孢子（图5）。

2.2.2

内生真菌GYP8 18SrDNA序列扩增及序列分析结果。甘草内生真菌GYP8 DNA经PCR扩增获得1条1 305 bp的特异性条带（图6），将测序结果在GenBank中进行Blast同源性比对，然后用MEGA5.05软件构建系统发育树（图7），内生真菌GYP8序列（登录号：KR233004）与Aspergillus fumigates（M60300.1）序列的同源性最高，相似性为99%。综合鉴定结果，确定甘草内生真菌GYP8为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。

3 结论

该研究从乌拉尔甘草叶片中分离得到内生真菌GYP8，对其进行活性代谢物研究发现，在其发酵液中存在大量活性化合物，并且存在与宿主植物乌拉尔甘草相似的化合物。选择内生真菌GYP8作为研究对象，对其进行系统研究，从其发酵液中分离得pseurotin A，对菌株GYP8进行菌种鉴定，结果为烟曲霉（Aspergillus fumigatus），该菌株为pseurotin A产生菌。

参考文献

[1] LI X J，ZHANG Q，ZHANG A L，et al.Metabolites from Aspergillus fumigatus，an endophytic fungus associated with Melia azedarach，and their antifungal，antifeedant，and toxic activities[J].J Agric Food Chem，2012，60（13）：3424-3431.

[2] MITCHELL J M，FINNEY N S.Synthetic studies of pseurotin A：Preparation of an advanced lactam aldehyde intermediate [J].Org Biomol Chem，2005，3（23）：4274-4281.

[3] ISHIKAWA M，NINOMIYA T，AKABANE H，et al.Pseurotin A and its analogues as inhibitors of immunoglobuline E production[J].Bioorganic & medicinal chemistry letters，2009，19（5）：1457-1460.

[4] 徐慧超，孙婷媛，翟李欣，等.产甘草次酸内生真菌RE7的鉴定及抑菌活性研究[J].中国新药杂志，2016，25（1）：102-105.

[5] 吴桐，白长胜，谭佳音，等.乌拉尔甘草内生真菌的分离及其抑菌活性研究[J].中国食品学报，2014，14（2）：154-160.

[6] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

[7] YANG Q X，ZHANG J，ZHU K F，et al.Influence of oxytetracycline on the structure and activity of microbial community in wheat rhizosphere soil[J].Journal of environmentan sciences，2009，21（7）：954-959.

[8] RATEB M E，HALLYBURTON I，HOUSSEN W E，et al.Induction of diverse secondary metabolites in Aspergillus fumigatus by microbial coculture [J].RSC Adv，2013，3（34）：14444-14450.