高粱种质资源SSR标记遗传多样性与农艺性状关联分析

田承华 程庆军 高海燕等

摘要 [目的]為充分了解高粱育种资源各性状特性，指导高粱杂交组合的配置及分子标记辅助育种，应用分子标记对高粱种质进行遗传多样性分析，并寻找部分与农艺性状相关联的分子标记。[方法]利用SSR（simple sequence repeat，SSR）标记分析55份高粱种质资源的遗传多样性，同时对8个农艺性状作表型鉴定，并利用GLM模型进行分子标记与农艺性状的关联分析。[结果]株高、穗宽、穗长、叶片数、旗叶长及宽等生长期性状都符合正态分布，单穗粒重和千粒重也符合正态分布；各供试材料的8个农艺性状均有极显著差异。10对SSR引物共扩增出64条带并检测到39个等位变异；多态性信息量（polymorphism information content，PIC）变化范围为0.685 6～0.948 3，平均为0.841 3；Shannon信息指数（I）和Neis基因多样性指数（H）平均为1.195 8和0.617 0。在遗传相似系数为0.731 7处UPGMA法将55份高粱材料聚为三大类，其中13份材料聚为A类，3份材料聚为B类，其余36份材料聚为C类。利用GLM模型分析结果表明，与穗宽、穗长、旗叶长、旗叶宽和千粒重5个农艺性状相关联的标记有4个，单个标记对表型变异的解释率为0.014 7～1.360 5。[结论]该研究为高粱种质资源精准分类、种质优势利用、育种效率提高等方面以及分子标记辅助育种提供基础资料。

关键词 高粱；SSR标记；农艺性状；遗传多样性；关联分析

中图分类号 S514 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）32-0026-07

Genetic Diversity and Association Analysis Using SSR Markers and Agronomic Traits in Sorghum

TIAN Chenghua， CHENG Qingjun， GAO Haiyan et al

（Sorghum Institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Genetic and Germplasm Innovation in Sorghum for Shanxi Province， Jinzhong， Shanxi 030600）

Abstract [Objective] To understand the agronomic traits of sorghum germplasm and to direct sorghum hybrid combinations as well as molecular marker assisted breeding， the genetic diversity of sorghum germplasm was analyzed and the molecular markers associated with agronomic traits were searched. [Method] The genetic diversity of 55 sorghum germplasm resources were assessed by simple sequence repeat （SSR） markers. We identified the phenotypic of eight agronomic traits and found SSR markers associated with plant height， spike width， spike length， leaf blade number， flag length and width， spike weight and thousandgrain weight using GLM （General Linear Model）. [Result] Eight agronomic traits were consistent with normal distribution and there are very significant differences， a total of 39 alleles were identified with 10 SSR markers. The average polymorphism information content （PIC） varied widely from 0.685 6 to 0.948 3 with an average value of 0.841 3，the average of Shannons information index （I） and Neis gene diversity index （H） were 1.195 8 and 0.617 0， respectively. Clustering analysis with UPGMA showed that the 55 materials could be divided into three groups at the genetic similarity coefficient of 0.731 7， thirteen materials were grouped into Class A， three materials were grouped into Class B， and the remaining thirtysix materials were grouped into Class C. Four markers were found to be associated with spike width， spike length， flag leaf length， flag leaf width and thousandgrain weight using GLM （General Linear Model）， and the phenotypic variation explained by a single marker ranged from 0.014 7 to 1.360 5. [Conclusion] This research provided fundamental data for the accurate classification of germplasm resources， advantage utilization of germplasms， enhancement of breeding efficiency and molecular mark assisted breeding of sorghum.

Key words Sorghum；SSR；Agronomic traits；Genetic diversity；Association analysis

基金项目 现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-06）；山西省重点研发计划重点项目（201703D211010）子项目“酿造专用高粱新品种选育”。

作者简介 田承华（1982—），男，山西原平人，助理研究员，硕士，从事高粱遗传育种研究。

收稿日期 2018-09-10

高粱（Sorghum bicolour）是一种重要的粮食、经济、能源等多功能 C4作物，在世界干旱及半干旱区种植的主要粮食作物之一，并且光合作用效率高，生物产量和经济产量大，同时具有很强的抗逆性和适应性，适合肥力贫瘠田的开发和利用[1]。高粱种质资源丰富，分布地域广，地方栽培品种和变种较多，经过几代高粱育种家60多年的研究发展，培育出大量优异的杂交种和种质资源。随着分子生物技术的飞速发展，亟需高粱育种家加强收集与鉴定遗传种质资源，同时需将农艺性状与分子标记相结合，进而为复杂数量性状的遗传学研究和分子标记辅助育种奠定重要基础。

随着分子生物学技术的快速发展，同工酶、RAPDs、RFLPs、ISSRs、AFLPs、SSR、EST-SSR、基因芯片（DArTTM）和SNP等分子标记技术已应用于遗传多样性分析[2-3]。其中，SSR（simple sequence repeats，简单重复序列）具有多态性高、数量丰富、重复性好、呈共显性且广泛分布于基因组等优点[4]，国内外有大量利用SSR标记进行高粱遗传多样性研究的相关报道。如Ni等[5]用25对SSR引物检测了29份糯高粱种质资源的遗传多样性，在遗传相似系数0.475处用UPGMA法将29份糯高粱品种聚为两大类，不同地理来源的品种被聚在同一亚类，农艺性状近似的品种聚为另一亚类；王瑞等[6]利用荧光测序与SSR分子标记相结合技术构建了20个高粱栽培品种DNA指纹图谱，为品种鉴别提供依据；Sawadogo等[7]用15对SSR引物检测了93份甜高粱种质资源的遗传多样性，结果聚为3大类，且A组（40份）与B组（43份）亲缘最远，B组与C组（9份）亲缘最近；Yusuf 等[8]用10对SSR引物将Ethiopia的26份高粱种质资源聚为4个主要类群。这些研究证明遗传多样性分析对于育种材料的遗传基础研究具有重要作用。

关联分析（association analysis）是基于连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）发现新等位基因的方法，可将目标表型性状的多样性与基因或位点的多态性相结合，分析与确定不同种质资源所携带的等位基因及其对应目标性状[9]。这曾被广泛应用于人类遗传学，目前已应用于水稻[10]、玉米[11]、小麦[12]等农作物，而依据农艺性状分析种质资源耗时、费力且周期长[13-14]。农艺性状与SSR标记的关联分析对群体结构分析显得尤其重要，其中SSR 标记用于高粱关联分析研究的报道较少。Upadhyaya等[15]利用43个SSR标记对242个高粱（Sorghum wlgare）品种的分蘖数和粒重进行关联分析，检测到1个标记与粒重相关、2个标记与分蘖数相关，确定1个氨基环丙烷羧酸合成酶基因（amino cyclopropane carboxylate，ACC）与分蘖数相关。

选育高粱品种是一个复杂漫长的过程，经过育种家长期的杂交与选育，积聚了多方面的优异种质，是目前最核心的遗传资源库。笔者应用SSR标记分析55份高粱种质资源的遗传多样性，并与8个农艺性状进行关联分析，从表型状态和DNA水平来协同筛选优势种质，为高粱种质资源精准分类、种质优势利用、育种效率提高等方面以及分子标记辅助育种提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为55份高粱种质，详情见表1，于2017年3月种植于山西省农科院高粱所植物培养室，出苗后采取新鮮嫩叶作为试材。

CTAB、Tris、饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、Taq酶、dNTPs等均购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 高粱生长指标的测定

1.2.1 田间试验设计。

55份高粱种质资源单株表型鉴定于2017年在山西省农科院高粱研究所试验田（中国晋中榆次）进行。采用5个重复的随机区组设计，选地块均匀，高低一致，水分管理方便的大田。试验材料设为单行区，行长5 m，行距 0.75 m，15 cm株距，种植密度大约为82 500株/hm2。每行随机选择5个单株用标签标示，调查标签标示单株表型。

1.2.2 大田农艺性状调查。

准确记载试材的出苗期、抽穗期和完熟期。成熟后随机考查不同试材的6个单株表型，包括株高、穗长、穗宽、叶片数、旗叶长和旗叶宽等性状。收获单穗考种和干燥脱粒，记录单穗粒重和千粒重。利用SPSS 21.0软件对相关性状进行数据统计分析。

1.3 基因组DNA的提取

采用改良的CTAB法[3]进行试材基因组DNA的提取，利用分光光度计及琼脂糖凝胶电泳法进行DNA浓度和纯度检测。

1.4 SSR引物序列与SSR扩展体系及电泳检测

参照国内外相关文献[16]，挑选40对SSR引物作为候选引物，委托上海生物工程技术有限公司合成。PCR反应在EDC-810热循环仪上进行，反应体系为：模板DNA 2 μL、10×PCR buffer（mg2+ Plus）2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.25 μL、0.1 mmol/L 引物 2 μL、1.25 U Taq DNA聚合酶，加ddH2O补足25 μL。

扩增结束后，每个PCR管加入6 μL上样缓冲液（98% 甲酰胺，10 mmol/L EDTA pH=8.0，0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青），混合后置于冰水混合物中。在电泳槽中加入足够的0.5×TBE缓冲液（0.09 mol/L Tris-硼酸，0.002 mol/L EDTA，pH 8.0），用吸管吹净点样孔中的气泡，加2 μl扩增产物混合物，100 W恒功率下，8%聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）电泳分离120 min，电泳结束后银染10 min，NaOH显色3 min，蒸馏水清洗3次，扫描记录[17]。

1.5 数据处理与分析

利用SPSS 21.0软件分析8个高粱关键农艺性状的正态分布和Q-Q-plot，并计算Pearson相关系数，以检测农艺性状间的线性相关关系。

对扩增谱带进行数据统计，强扩增带记为“1”，无扩增带或者弱扩增带记为“0”，得到原始数据，根据不同软件的格式要求做相应转换。NTSYS-pc软件进行遗传多样性分析并基于UPGMA法绘制聚类树，计算遗传相似系数（genetic similarity，GS）；Popgene 32计算Shannon指数（I）、Neis基因多样性指数（H）、观察杂合度（Ho）和期望杂合度（He）；Structure 2.3.1软件分析群体遗传结构；Tassel 5.0以一般线性模型（general linear model，GLM）进行关联分析，GLM分析中以Q值作为协变量进行回归分析。

2 结果与分析

2.1 高粱农艺性状调查

从图1可以看出，株高、穗宽、穗长、叶片数、旗叶长及宽、单穗粒重和千粒重8个农艺性状都符合正态分布，并且所有农艺性状大体上呈连续变异，表明为多基因控制的数量性状。从表2中可以看出，株高、穗宽、穗长、叶片数、旗叶长、单穗粒重和千粒重等偏度均大于0，说明分布成正偏态；而旗叶宽偏度小于0，说明分布成负偏态。

2.2 55份高粱供试材料的8个农艺性状及其差异分析

利用 SPSS对8个农艺性状的平均值、极差、标准差和变异系数进行计算。标准差在不同种质材料间存在较大差异，依次为穗粒重>株高>旗叶长>千粒重>穗长>叶片数>穗宽>旗叶宽。在8个性状中，标准差最大的是穗粒重16.71，变幅为53.50～127.70。标准差最小的是旗叶宽1.17，变幅为4.20～8.10。由此可知，各高粱试材穗粒重和其平均值间的差异较大，而旗叶宽与其平均值间的差距最小（表2）。由表2可知，8个性状的变异系数为10.89%～19.53%，其中穗粒重的变异最大，其次是千粒重，两者变异系数均大于19%；而叶片数的变异最小，为10.89%。

对8个农艺性状间的线性相关分析表明，穗长与株高，穗宽与穗长，叶片数与穗宽，旗叶宽与旗叶长，穗粒重与穗长，千粒重与穗粒重之间均呈极显著正相关（P<0.01）；旗叶宽与穗宽，穗粒重与株高，穗粒重与穗宽，穗粒重与旗叶长间呈显著的正相关（P<0.05），其他性状之间没有显著的相关性（表3）。

2.3 SSR引物筛选及多态性分析

由表4可知，从40对引物中筛选出10对多态性丰富、扩增谱带清晰的引物；对55份高粱材料遗传多态性分析，共获得64条DNA扩增片段，其中有39个等位变异，平均多态性条带百分率（PPB）为60.937 5%，分子量为200～1 000 bp。多态性信息量（PIC）变化范围为0.685 6～0.948 3，平均值为0.841 3，以引物Xcup02最低，引物gpsb069最高，这说明引物Xcup02的遗传多样性较丰富，而引物gpsb069的遗传多样性较狭窄。

10对引物的等位变异数（NA）变幅为2～8条，平均3.9条；有效等位变异数（NE）为1.273 7～8.509 1，平均为3.206 6；Shannon信息指数（I）变幅为0.456 7～2.250 3，平均为1.195 8；观察杂合度（Ho）变幅为0.072 7～0.981 8，平均为0.745 5，反映杂合位点在基因组中所占比例高；期望杂合度（He）的变化幅度为0.216 3～0.744 0，平均为0.622 7，表明试材普遍存在杂交，杂交率较高。Neis基因多样性指数（H）的变化幅度为0.214 9～0.882 5，平均为0.617 0，表明所选引物扩增的多态性存在较大的差异，遗传多样性丰富。经10个SSR标记扫描分析，55份高粱材料的遗传相似系数（GS）变异范围为0.355 0～0.968 3，平均值为0.747 7。其中，765与763的GS值最大（0.968 3），表明二者亲缘关系最近；776与772GS值最小，为0.355 0，说明二者亲缘关系最远。

2.4 SSR高粱种质聚类分析

采用NTSYS-pc 软件基于 UPGMA 法进行聚类分析，图 2表明55份高粱材料在GS值为0.7317处被聚为3个大类。A类包含13份材料；3份材料聚为B类，750独自为一小类；738和751为另一小类；C类材料来源较丰富，其余36份材料聚为一类。

2.5 参试材料群体结构分析

应用已筛选出多态性丰富的10个 SSR 标记进行群体遗传结构分析，结果发现样本的等位变异频率特征类型数K呈持续增大（图 3A）。Structure 2.3.1软件对参试材料进行群体结构划分，由图3B可以看出ΔK在K=7时出现拐点，由此判断55份高粱群体可被分为 7 个亚群，并绘制供试材料群体结构图（图4），将各个材料的对应Q值作为协变量纳入SSR标记与表型性状变异的回归分析中。

2.6 SSR标记与农艺性状关联分析

采用 TASSEL 5.0 软件的一般线性（general linear model，GLM）模型进行引物标记位点与农艺性状的关联分析，以各试材的对应Q值为协变量，将SSR标记基因型与高粱8个农艺性状（株高、穗宽、穗长、叶片数、旗叶长及宽、单穗粒重和千粒重）进行关联分析，GLM结果显示，共检测到 4个标记与5个农艺性状在P<0.01水平上相关，表型变异解释率为 0.014 7～1.360 5（表 4）。其中，gpsb089标记与穗宽和旗叶宽极显著相关；Xcup02标记与穗长极显著相关；mSbCIR240与旗叶长极显著相关，解释率最大为1.360 5；Xtxp141與穗宽和千粒重极显著相关，解释率分别为0.014 7和1.058 7，与穗宽的解释率最小。

3 讨论

3.1 高粱SSR分子标记遗传多样性分析

种质资源是进行育种工作的基础，丰富的遗传种质资源是育种材料创新及优异基因聚合的基础条件。因此分析种质资源的遗传多样性、比较种质间亲缘关系的远近，对于选育工作和种质资源的利用尤其重要。利用SSR分子标记技术进行高粱遗传多样性的研究，国内外已有报道[18-21]。该研究选用的10对SSR 标记能够较全面地分析55份高粱材料的遗传多样性，共获得64条DNA扩增片段，有39个等位变异，多态百分率（PPB）为60.937 5%，其多态性信息量（PIC）、Shannon信息指数（I）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和Neis基因多样性指数（H）的平均值分别为0.841 3、1.195 8、0.745 5、0.622 7和0.617 0。GELETA等[19]利用AFLPs、SSRs和农艺性状来评估45份高粱种质资源的遗传多样性，其中多态性信息量（PIC）分别为0.65（AFLPs）和0.46（SSRs），Shannon信息指数中农艺性状（0.678）比AFLP（0.487）和SSR（0.539）都较高，同时AFLP和SSR都可以标识所有的种质，而通过形态学有2个种质无法区分开。在遗传相似系数为0.731 7处UPGMA法将55份高粱材料聚为三大类，A类包含13份材料，B类包含3份材料，C类包含36份材料，通过与材料组合比较来看，基本上组合相近的材料大部分聚为一类。但也有部分材料如（748-758、998-999）等，这表明在育种家对育种材料选择的过程中，在不同的选择压力与方向上使相同来源的种质资源表现较大差异的基因型和表型。因此，在育种中对于材料的分类运用必须依靠分子标记技术进行准确的分类鉴别，从而提高育种材料的鉴定利用效率。赵香娜等[20]用24对SSR引物分析206份国内外甜高粱种质资源的遗传变异，在遗传相似系数0.762将其分为两大类，其中B组只包含3个品种，与其他品种遗传关系较远。倪先林等[21]用25对SSR引物检测29份糯高粱种质資源的遗传多样性，在遗传相似系数0.475处聚为两大类，不同地理来源的品种被聚在同一亚类，农艺性状近似的品种聚在同一亚类。这些都充分地利用SSR标记将不同类别、地域的高粱种质资源区分开来，进而为筛选优质育种材料提供基础依据。

3.2 高粱分子标记的关联分析

关联分析通过分析种质资源中标记与QTL间关系，直接对基因型和表型的变异进行分析，可确定不同种质资源中所携带的等位基因及其对目标性状的贡献[9]。种质资源进行遗传多样性及群体遗传结构分析，是关联分析的前提[22]。在遗传相似系数为0.731 7水平上将55份高粱材料聚为3个大类，分别包括 13、3和36份材料，而基于GLM模型的群体结构分析表明，这些资源可以分为7个亚群，分别包括8、13、6、4、14、3和7份材料，两者的结果差异较大。出现这样的差异主要因素是聚类分析反映个体间亲缘关系的远近，而群体遗传结构分析是基于亚群是否达到哈德温伯格平衡的数学模型并计算Q值[23]，该研究利用Structure软件校正55份材料所存在的群体结构，可避免人为因素对亚群划分的影响[24]。利用GLM模型进行关联分析发现，与穗宽、穗长、旗叶长、旗叶宽和千粒重5个农艺性状相关联的标记有4个，其中，gpsb089与穗宽和旗叶宽关联标记；Xcup02与穗长关联标记；mSbCIR240与旗叶长关联标记，Xtxp141与穗宽和千粒重关联标记。Bhosale等[25]发现一些SNP标记与非洲中西部高粱材料的光周期开花时间基因 CRYPTOCHROME 1（CRY1-b1）和 GIGANTEA（GI）相关。GELETA等[19]利用AFLPs、SSRs和农艺性状来评估45份高粱种质资源的遗传多样性，发现AFLP和SSR标记以及形态学和SSR标记的遗传关系的估计值显著相关（P<0.001），而形态学和AFLP数据显示无显著相关性（P>0.05）。Upadhyaya等[15]利用43个SSR标记对242个高粱（Sorghum wlgare）品种进行关联分析，检测到1个标记与粒重、2个标记与分蘖数相关。由此通过农艺性状与分子标记进行相关性分析，就可找到与目标性状相关联的标记，可用于分子标记辅助选择育种，提高优选效率，通过表型鉴定与分子标记相结合，相互验证可加速目标基因的聚合，缩短连续选择时间，提高选择效率，进而为高粱优良种质创新提供理论方法依据。

4 结论

8个农艺性状间部分性状存在显著或极显著的线性相关性，以GLM模型关联分析发现4个SSR标记与5个农艺性状在P<0.01水平上相关，表型变异解释率范围为0.014 7～1.360 5，为高粱农艺性状的分子标记辅助选择奠定了基础。

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