西藏圆齿红景天茎内曲霉属真菌系统发育分析

向明学 金鹏杰 段双全 许鹏辉 拉多

摘要[目的]对从健康的新鲜西藏景天科植物圆齿红景天茎内分离得到的曲霉属菌株进行形态学观察以及从分子生物学水平进行分离鉴定。[方法]用载片培养法进行菌株的判定和生物学特性的试验，利用rRNA基因ITS间隔区建立进化树分析法，进行该真菌的系统发育阐明。[结果]菌落在改良型KB培养基上和PDA培养基上形态表现一致，起初菌落为白色绒毛状，边缘列片状，浓密而不透明，基部菌丝体厚、平坦，具沟纹、绒毛状质地，菌株为无性型。通过分子生物学的rRNA基因ITS间隔区系统发育建立进化树的方法鉴定分离出的菌株为曲霉属黄绿组真菌。[结论]通过对菌落外部形态的观察、分析以及从分子生物学角度的无性型rRNA基因ITS间隔区系统发育分析，得知分离得到的菌株属于半知菌亚门曲霉属黄绿组真菌的一种。

关键词圆齿红景天；曲霉属黄绿组；系统发育；ITS间隔分析；西藏

中图分类号S567.23文献标识码

A文章编号0517-6611（2018）05-0117-03

Abstract[Objective]The morphological observations of Aspergillus strains isolated from the stem of the healthy fresh Tibet crassulaceae plants were studied and the separation and identification were conducted from the molecular biological level.[Method]The determination of the strains and the biological characteristics of the strain were carried out with the method of carrying plate culture，and the evolution tree analysis was established using the rRNA gene ITS interval region，and the system development of the fungus was elucidated.[Result]Colony in modified form KB medium and form was consistent in PDA medium，at first colony for white villous，edge column flake，dense and opaque，mycelium thick at base flat provides quality，grooving villous strains for asexual.The isolated strain of the evolutionary tree were identified as the yellowgreen group fungus of Aspergillus by the molecular biology of the rRNA gene ITS interval regional system development.[Conclusion]Through the observation and analysis of the external morphology of the colony and the phylogenetic analysis of the ITS spacer region of the asexual rRNA gene from the point of view of molecular biology，it is known that the isolated strain belongs to the fungus of the yellowgreen group of Aspergillus.

Key wordsRhodiola crenulata；Yellow and green groups of Aspergillus；Phylogeny；ITS interval analysis；Tibet

圆齿红景天（Rhodiola crenulata），为蔷薇目景天科（Crassulaceae）红景天属（Rhodiola L.）多年生的草本植物，其主要分布在青藏高原，在我国四川、甘肃、云南等地也都有分布[1]。其根和茎多数可以入药，据《四部医典》记载红景天有治疗心血管疾病和肺结核的功效，现代医学研究表明，红景天还具有抗缺氧、抗疲劳的功效[2-3]，但对其植物内生菌的研究甚少。该试验基于健康的新鲜西藏圆齿红景天茎内曲霉属黄绿组真菌的鉴定，采用形态学观察与分子生物学rRNA基因ITS间隔区系统发育分析的方法相结合，并对其生态特征进行鉴定，有助于進一步鉴定圆齿红景天内生菌种类和真菌的次生代谢产物的作用以及产物的理化性质的分析，从而为红景天药用价值的开发与利用提供微生物学上的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料。试验样品为健康的新鲜西藏景天科圆齿红景天植株，来自西藏自治区林芝地区工布江达县米拉山东坡，海拔5 013 m。

1.1.2培养基。PDA培养基：葡萄糖10 g、土豆200 g、琼脂15 g、蒸馏水，定容到1 000 mL。改良型KB培养基：葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、酵母膏1 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、琼脂20 g；定容到1 000 mL[3-4]。

1.1.3分子生物学试剂。DNA提取试剂：PBS缓冲液、Lyticase（sigmaL4025）、DNA快速提取试剂盒（货号DN1112）。PCR扩增试剂：ITS1和ITS4引物、2XTaq MasterMix测序试剂盒、1.2%琼脂糖、ABI BigDye Terminator v3.1测序试剂盒、扩增50 μL体系。引物序列为：ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC。

1.2试验方法

1.2.1样品处理和培养方法。

将样品用自来水洗净之后，在无菌接种通风箱中，用巴氏消毒液反复冲洗样品表面，并放入接种箱内紫外灭菌30 min；然后取样品的茎切成长3～4 cm，再纵向对切，并放入盛有次氯酸钠溶液的烧杯中10 min；再依次用硫代硫酸钠、乙醇、无菌水冲洗，接入改良型KB培养基和PDA培养基中，将接种后的2种培养基放入25 ℃恒温培养箱中连续培养12 d。

1.2.2菌株的分离纯化。12 d后取2种培养基，在无菌接种通风箱中，用灭菌后的接种环将2种培养基所得的菌落挑取、接种到新的改良型KB培养基和PDA培养基中，接种完毕后放入25 ℃恒温培养箱中连续培养12 d。以此培养方法重复多次，直至所得菌株形态、颜色一致，并无其他杂菌混入，那么所得菌株即为目的菌株。

1.2.3菌株及菌株孢子形态观察方法。

将从西藏圆齿红景天茎内分离得到的目的菌株接种于改良型KB培养基和PDA培养基上，观察其菌丝的生长状态、孢子的颜色以及改良型KB培养基和PDA培养基基质的颜色[4]。

挑取少许目的菌株，以点接的方式接入到配置好的PDA和改良型KB培养基中，放入23～25 ℃智能温控培养箱培养；观察到培养基表面菌丝刚开始生长时，用已消毒好的医用手术刀切取长宽为2 cm×2 cm的培养基移到灭菌的载玻片上并盖上盖玻片[5]，放入智能温控培养箱中，湿度控制在60%～80%继续培养，在显微镜下2 d观察一次孢子的发育情况。

1.2.4PCR试验。

1.2.4.1菌株DNA的提取。

挑取真菌菌丝，加到PBS缓冲液中，加入100 μL的Lyticase（sigma L4025），37 ℃破壁处理30 min。然后用细菌基因组DNA快速提取试剂盒（货号DN1112）提取基因组DNA，提取的DNA用于基因扩增。

1.2.4.2rRNA基因ITS区间片段的扩增。使用2XTaq MasterMix扩增（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；引物由北京博迈德基因技术有限公司提供）；扩增50 μL体系：10×buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，上下游引物各2 μL，加入模板2 μL，rTaq酶0.25 μL，最后加超纯水至50 μL。反应条件为94 ℃预变性300 s；94 ℃变性50 s；58 ℃退火50 s；72 ℃延伸60 s；如此循环30次，最后72 ℃补齐10 min。

1.2.4.3rRNA基因ITS区间片段序列的测定。

配置1.2%的琼脂糖DNA胶，对得到的扩增产物进行凝胶电泳鉴定，条带涌动到合适位置时，在凝胶成像中找到目的条带并进行回收。对回收到的目的条带送往北京博迈德基因公司进行DNA序列测定。

2结果与分析

2.1菌株形态在25 ℃恒温培养箱中培养连续12 d后，发现在PDA培养基和改良型KB培养基中得到的2种菌株在颜色、形态、气味上均一致，故该试验用改良型KB培养基分离纯化所得的菌株为主要研究对象。其分离纯化所得的菌株形态有以下特征：

①菌株菌落呈现绿色而且略带黄色菌落，菌落整体较为疏松，表面有部分已经分化产生孢子，所以出现浅淡黄绿色粉末，散发出较淡的霉味（图1a）。②分生孢子头主要有辐射形或柱形2种，颜色以较浅的黄绿色为主，同时呈现渐进变化，由菌落边缘至中心颜色逐渐加深（这与菌落老化后的代谢物以及菌落本身的性质有关），呈现出由浅到深的状态（图1b）。③分生孢子头顶囊呈圆形，多以球状出现，其梗部由两部分组成，第1部分位于外层，第2部位于内层，其外层为未完全成熟的分生孢子，类似于放射线的形式较均匀地在顶囊排布，而外层表面大都为基本成熟且即将脱落的分生孢子，以链状为主（图2）。④分生孢子梗茎透明，表面常有细小绒毛状凸起或凹陷不光滑，但有少数壁光滑，顶囊圆形或者不规则的球形，少数会呈现特殊的圆柱状，大多数均可产生具有生殖能力的分生孢子。⑤分生孢子的产生较为复杂，与大多数单一的双层产孢有差异，其孢子有单层又有双层，即使在同一个顶囊，也有较大的差异，其产孢结构既可单双兼有又可只具其一。⑥少数菌由于次生代谢物以及生境或者其他较复杂的因素影响甚至会产生菌核。⑦菌株气生菌丝形成的梗茎不分枝，表面光滑透明、长度为65 μm，宽1.2 μm；分生孢子头黑色，外形为疏松柱状，平均直径为12 μm（图1c、图2）。

2.2rRNA基因ITS区间片段的系统发育分析

测得的ITS序列提交到NCBI网站，登录号为KT831451，运用BLAST进行在线比对，得到许多相似性序列，并下载相似性较高的作为参考序列，运用Clustal_X2.0软件进行比对排定；利用生物进化数据分析方法及进化树软件对进化距离（1 000 bp）进行计算并建立系统发育的进化树。

使用BLAST在线相似性比对引擎，对序列做相似性分析。对无法人工判定的高覆盖率和高相似度比对结果，采用Aspergillus sp.BM6 KJ567461做外群比对，运用MEGA5.0和Clustal_X2.0软件构建系统发育树，得到菌株的聚类分析情况（图3）。从图3可以看出，该菌株（X01 KT831451）属于曲霉属的真菌。

3讨论

对比中国真菌志（第五卷）中，将该菌株归属到曲霉属黄绿组真菌的一种。然而，在梗基和瓶梗形态上的描述，与常规的模式物种不尽相同。从不同的分类学方法进行分析，该菌株可以被定位在不同的进化位置，若从真菌的超微形态进行分类，该菌株可以归类于一种淡色孢科曲霉属真菌[6]；若从普通真菌学出发，该菌株则被归类于丛梗孢科曲霉属真菌[7]；在中国菌物中也将其归类到半知菌类丝孢刚丝孢目淡色孢科曲霉属真菌的一种[8]。该菌株是从健康的新鲜西藏圆齿红景天茎内分离得到的曲霉属真菌，通过分子生物学的rRNA基因ITS间隔区系统发育分析，最终确立所研究菌株在系统进化上的确定位置，即曲霉属黄绿组真菌。但是其具体所属种还得做进一步相关的生理生化试验进行鉴定。

参考文献

[1]

中国科学院青藏高原综合科学考察队.西藏植物志：第2卷[M].北京：科学出版社，1983：68-69.

[2] 倪志诚.西藏经济植物[M].北京：北京科学技术出版社，1990：250-261.

[3] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草：藏药卷[M].上海：上海科学技术出版社，2002：178-179.

[4] 段双全，邢顺林，许鹏辉.西藏龙胆根内寄生附球霉属真菌菌株特性研究[J].安徽农业科学，2012，40（29）：14168-14171.

[5] 邢顺林，段双全，许鹏辉.冬青卫矛茎内寄生链格孢属真菌生物学特性分析[J].广东农业科学，2012，39（19）：131-133.

[6] 康振生，黄丽丽，李金玉.植物病原真菌超微形态[M].北京：中国农业出版社，1997：168-169.

[7] 邢來君，李明春，魏东盛.普通真菌学[M].北京：高等教育出版社，2010：172-175.

[8] 林晓明，李振岐，侯军，等.中国菌物[M].北京：中国农业出版社，2007：155-158.