延边烟区烟草菌核病病原菌鉴定及抗性种质筛选

高崇 吴国贺 李佰霖 安承荣 高歌农 卢宝慧 高玉亮 田慧敏 郑成叡 崔昌范

摘 要：为防控延边烟区烟草菌核病提供基础资料和理论依据，开展了病原菌鉴定及抗性种质材料筛选研究。将收集的病原菌核采用常规方法进行分离、纯化，经致病性测定、形态学特征观察、rDNA-ITS测序比对及基于rDNA-ITS序列的系统发育分析，鉴定病原菌种类；并采用离体叶片法、活体叶片法对61份种质材料进行抗性筛选。结果表明：（1）经形态学、分子生物学方法鉴定該病原菌为核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]。（2）两种方法筛选出31份高感材料、6份中感材料、15份抗病材料，鉴定结果一致率为85.25%，未筛选到免疫和高抗种质材料。延边烟区烟草菌核病病原菌为核盘菌，离体叶片法、活体叶片法可用于苗期烟草种质材料对菌核病抗性筛选。

关键词：烟草菌核病；离体叶片法；活体叶片法；抗性种质

中图分类号：S435.72 文章编号：1007-5119（2018）02-0069-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.02.010

Identification of Tobacco Sclerotinia Rot in Yanbian and Screening for Resistant Germplasms

GAO Chong1， WU Guohe1， LI Bailin1， AN Chengrong1， GAO Genong2， LU Baohui3，

GAO Yuliang1， TIAN Huimin4， ZHENG Chengrui5， CUI Changfan1*

（1. Yanbian Academy of Agricultural Sciences， Longjing Jilin 133400， China； 2. Jilin Tobacco Monopoly Administration （Company）， Changchun 130000， China； 3. College of Agricultural， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China； 4. College of life sciences， Chifeng university， Chifeng， Inner Mongolia 024000， China； 5. Yanbian Branch of Jilin Tobacco Corporation Company， Yanji， Jilin 133000， China）

Abstract： Identification of pathogen and screening for resistant germplasm materials were conducted for providing fundamental data and theory for controlling tobacco sclerotinia rot in Yanbian tobacco areas. The sclerotium of pathogen were collected in 2015， and then isolated and purified by conventional methods. Pathogen was identified through pathogenicity test， morphological characteristics， sequence analysis of the internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA （rDNA-ITS） and phylogenetic analysis based on rDNA-ITS sequences. 61germplasm materials were screened by in vitro leaf-assay method and living leaf-assay method. The results showed that： （1） The pathogen was identified as [Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary] by morphology and molecular biology methods. （2） 31 high sensitive germplasms， 6 medium sensitive germplasms and 15 resistance ones were identified by the two methods with a consistent rate of 85.25%. No immune or high resistant germplasms，was identified. The pathogen of tobacco sclerotinia rot was [Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary] in Yanbian tobacco areas. In vitro leaf-assay and living leaf-assay methods can be used to screen the resistance of germplasm materials to sclerotinia rot at seedling stages of tobacco.

Keywords： tobacco sclerotinia rot； vitro leaf-assay method； living leaf-assay method； resistant germplasm

吉林省延边州植烟历史悠久，生产的烟叶品质在国内独树一帜，深受全国卷烟企业喜爱。烟草有害生物是影响延边烟区优质烟叶生产的因素之一，经2010—2014年有害生物调查发现，烟草菌核病（Tobacco sclerotinia rot）在吉林省延边烟区有逐年加重危害趋势，烟株茎部（叶片）感染病原菌后，

基金项目：吉林省烟草专卖局（公司）项目“吉林省烟草有害生物调查研究”{[2010]83号}

作者简介：高 崇（1981-），男，副研究员，主要从事烟草有害生物综合治理研究。E-mail：gchong1981@126.com

*通信作者，E-mail：1656242643@qq.com

收稿日期：2017-10-10 修回日期：2018-01-10

叶片变黄凋萎，失去应用价值[1-2]。据报道，美国、日本等国家已发现烟草菌核病；该病害在广东、广西、贵州、四川、湖北、浙江、安徽、黑龙江等省（自治区）烟区亦有发生[3]。明确病原菌种类是开展科学防控的基础。近年来，随着分子生物学技术的迅猛发展，核糖体内部转录间隔区（rDNA-ITS）在病原菌种类鉴定中被广泛应用，较单一传统生物学鉴定更加准确、便捷。王静等[4]通过病原菌形态学特征及18S rDNA序列分析，明确山东烟草白绢病病原菌为齐整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）；杨涛等[5]通过形态学观察、rDNA-ITS和Plasma membrane ATPase（ATPase）基因进行测序分析，进一步证实湖北烟区烟草赤星病为链格孢（Alternaria alternata）、长柄链格孢（A. longipes）、细极链格孢（A. tenuissima）和鸭梨链格孢（A. yaliinficiens）侵染所致。防治植物病害最有效的方法是种植抗病品种，而抗性种质是抗病育种的基础，董利东等[6]从全国11个省份286份野生大豆资源中筛选出34份菌核病抗性种质材料；申宏波等[7]对黑龙江省346份种质资源进行大豆菌核病耐病性鉴定，从中鉴定出2级耐病种质3份、1级耐病种质3份。然而，有关烟草菌核病上述研究未见报道。本文对吉林省延边烟区烟草菌核病病原菌采用形态学、分子生物学方法进行种类鉴定，并开展抗性资源筛选研究，为病害的科学防控及抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌鉴定

1.1.1 供试病原菌收集、分离与纯化 供试病原菌核于2015年10月采自吉林省延邊烟田内患菌核病烟株茎秆，带回实验室，采用组织分离法[8]进行分离、纯化，获得纯培养菌株。

1.1.2 致病性测定 在温室内，采用伤口菌碟贴茎接种保湿法[9]。接种时间为2015年11月8日，接种7 d后，观察记载茎部接种处症状，对照茎部接种PDA培养基。显症后再次分离鉴定该病原菌，完成柯赫氏法则验证。

1.1.3 病原菌形态观察 将菌株重新接种于PDA培养基上，28 ℃恒温培养，逐日观察培养基上菌落特征及菌核形态、色泽变化，光学显微镜下观察菌丝形态[3，10]。

1.1.4 病原菌rDNA-ITS序列测定 采用改良CTAB法[11]提取基因组DNA。采用真菌核糖体内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）通用引物ITS4（5?-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3?）和ITS5（5?- GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3?）扩增病原菌rDNA-ITS序列，引物由上海生工生物公司合成。25 μL PCR反应体系为：2×PCR Mix 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL，以无菌双蒸水补足至25 μL；扩增程序：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s；55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收DNA片段，进行测序，将测序结果在GenBank数据库中进行比对；并采用MEGA5.0软件，构建系统发育树。

1.2 抗性种质材料筛选

1.2.1 供试种质材料 供试种质材料由延边农业科学院烟草研究所收集并保存，具体明细见表1。于2016年冬季在温室内盆栽各供试种质材料30株，栽植土壤草炭∶蛭石体积比为2∶1，烟苗进行常规管理。

1.2.2 抗性鉴定方法 待盆栽烟苗第1片真叶长10 cm时，采用离体叶片法、活体叶片法[12-16]进行接种，20～25 ℃保湿培养，3 d后调查接种叶片病斑大小。同一方法每份种质接种5株，设3次重复。

1.2.3 分级方法 依据接种3 d后叶片病斑大小进行病害分级[12]：0级，无症状或症状不明显；1级，形成直径1～4 mm水渍状黄褐色病斑；2级，形成直径5～9 mm水渍状黄褐色病斑；3级，形成直径10～14 mm水渍状黄褐色病斑；4级，形成直径15～19 mm水渍状黄褐色病斑；5级，形成直径>20 mm水渍状黄褐色病斑。

1.2.4 抗性标准 采用相对抗病程度方法划分种质材料对菌核病抗性能力[17]，用相对抗病指数（Relative resistant index，RRI）来表示，免疫（I）：RRI=1.0；高抗（HR）：0.80≤RRI<0.99；抗病（R）：0.40≤RRI<0.79；中感（MS）：0.20≤RRI<0.39；高感（HS）：RRI<0.20。

1.2.5 病情指数计算公式 病情指数=[∑（各级病斑数×各级代表值）/（调查总病斑数×最高病级代表值）]×100

相对抗病指数（RRI）=1-（鉴定品种平均病情指数/发病最严重品种平均病情指数）

1.2.6 数据处理 利用DPS软件处理分析数据，采用Duncan新复极差法进行方差分析。

2 结 果

2.1 病原菌鉴定

2.1.1 致病性测定 致病性测定结果表明，分离自吉林省延边烟田内的菌株能够致病烟草。接种7 d后，即可见烟株茎部有大量的白色菌丝和白（黑）色菌核产生（图1）；接种10 d后，烟苗心叶变褐死亡，并有白色菌丝产生（图2）。

2.1.2 病原菌形态观察 菌落呈圆形，菌丝白色，棉絮状，不产生色素；7～10 d后，在培养基边缘形成不定形菌核，菌核表生，先期白色，后渐变为黑色，表面粗糙，直径5～10 mm（图3）。显微镜下观察菌丝无色、透明、有隔膜，呈多分枝状且在菌丝的短侧枝顶端产生小型分生孢子（图4）。

2.1.3 病原菌rDNA-ITS序列测定 将测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对，其与已登记Sclerotinia sclerotiorum真菌rDNA-ITS序列相似，同源性达99%。使用MEGA 5.0软件，选择灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）作为外类群，构建系统发育树，结果该病原菌与已鉴定为S. sclerotiorum真菌（登记号为MG249968）聚类在一起（图5）。

经形态学、分子生物学方法鉴定该病原菌为核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）deBary]，引起烟草菌核病。

图1 烟株茎部接种病原菌（左图）与对照（右图）

Fig. 1 The stems inoculated with pathogen （left） and CK （right） 图2 病原菌回接烟株叶片

Fig. 2 The leaves inoculated with pathogen

图3 PDA培养基上病原菌培养性状

Fig. 3 Cultural characteristics of the pathogen on PDA 图4 病原菌菌丝显微形态

Fig. 4 Micro-morphology of pathogen hypha

图5 病原菌与基因库（GenBank）中同源性较高菌株的rDNA-ITS序列系统发育树

Fig. 5 Phylogenetic tree of rDNA-ITS sequence of high homology strains from the pathogen and GenBank

2.2 抗性種质材料筛选

由表1可知，离体叶片法接种的种质材料病情指数高于活体叶片法。两种方法将61份种质材料划分为高感（HS）、中感（MS）、抗病（R）3个类群，有52份鉴定结果一致，占测试种质材料的85.25%，其中包括Friedrichstaier、Geudetthelmex、CF222、CF223等31份高感材料，平均病情指数80.67～100；温德尔、优选1号、湄潭烤烟、三道1号等6份中感材料，平均病情指数62.67～74.67；黑

苗2645、永定1号、K730、广东56号等15份抗病材料，平均病情指数32.67～60.00，感/抗材料比接近3：1。9份鉴定结果不一致，均相差1个抗性等级，其中HS-MS包含7个、MS-R包含2个。Friedrichstaier品种（系）在测试中表现出的抗性水平最低，平均病情指数为96.34；九楼烟品种（系）表现的抗性水平最高，平均病情指数为33.00。在本次测试中未筛选到免疫和高抗种质材料。

表1 烟草种质材料对菌核病抗性情况

Table 1 Resistance of germplasm resources to tobacco sclerotinia rot

编号

No. 品种（系）名称

Variety（strain）name 离体叶片法

In vitro leaf-assay method

平均病情指数 抗性级别

Average disease index Resistance degree 1 活体叶片法

Living leaf-assay method

平均病情指数 抗性级别

Average disease index Resistance degree

32 S01-006 100 a A HS 76.00 hij GHIJK MS

33 Friedrichstaier 100 a A HS 92.67 abcd ABCD HS

34 Geudetthelmex 100 a A HS 82.67 defgh CDEFGH HS

37 CF222 100 a A HS 89.33 abcde ABCDEF HS

38 CF223 100 a A HS 92.00 abcd ABCD HS

28 NC567 99.34 a AB HS 78.67 fghi EFGHI MS

35 HavanaIIc 99.34 a AB HS 94.67 abc ABC HS

29 V2 99.34 a AB HS 84.00 defgh CDEFGH HS

41 LJ237 98.67 ab AB HS 94.67 abc ABC HS

25 小立耳 98.67 ab AB HS 88.67 bcde ABCDEFG HS

48 LJ981 98.00 abc AB HS 88.67 bcde ABCDEFG HS

43 铁杆青 96.67 abcd ABC HS 90.00 abcd ABCDEF HS

30 大甲川烟 96.67abcd ABC HS 94.67 abc ABC HS

47 NC89 96.67 abcd ABC HS 94.67 abc ABC HS

46 三道2号 96.67 abcd ABC HS 76.00 hij GHIJK MS

55 大平板 94.67 abcde ABCD HS 89.33 abcd ABCDEF HS

58 G28-46 94.00 abcde ABCD HS 88.67 bcde ABCDEFG HS

57 H7OE-2 93.34 abcdef ABCD HS 83.33 defgh CDEFGH HS

36 CF219 92.86 abcdefg ABCD HS 97.67 ab AB HS

54 大毛柳 92.00 abcdefg ABCD HS 86.00 cdefg ABCDEFG HS

56 RGOB-18 92.00 abcdefg ABCD HS 80.00 efghi DEFGH MS

40 CF225 90.67 abcdefgh ABCD HS 84.00 defgh CDEFGH HS

42 LY0414 90.67 abcdefgh ABCD HS 90.00 abcd ABCDEF HS

表1 （續）

Table 1 （Continued）

编号

No. 品种（系）名称

Variety（strain）name 离体叶片法

In vitro leaf-assay method

平均病情指数 抗性级别

Average disease index Resistance degree 活体叶片法

Living leaf-assay method

平均病情指数 抗性级别

Average disease index Resistance degree

50 吉烟五号 90.00 abcdefgh ABCD HS 85.33 cdefgh BCDEFGH HS

31 印尼02号 89.34 abcdefgh ABCDE HS 86.67 cdefg ABCDEFG HS

24 歪把子 88.00 bcdefgh ABCDEF HS 73.33 ijk HIJKL MS

27 G80B 88.00 bcdefgh ABCDEF HS 98.67 a A HS

39 CF224 87.34 cdefgh ABCDEF HS 77.33 ghi FGHIJ MS

45 大沙河烟 87.34 cdefgh ABCDEF HS 90.67 abcd ABCDE HS

44 小沙河烟 86.67 defghi ABCDEFG HS 91.33 abcd ABCDE HS

53 LJ911 86.00 defghi ABCDEFG HS 88.00 bcdef ABCDEFG HS

52 中烟98 86.00 defghi ABCDEFG HS 84.67 defgh CDEFGH HS

26 革新3号 85.33 efghi BCDEFG HS 86.00 cdefg ABCDEFG HS

49 吉烟七号 82.67 fghij CDEFGH HS 92.00 abcd ABCD HS

51 潘圆黄 82.67 fghij CDEFGH HS 84.00 defgh CDEFGH HS

61 吉烟九号 82.00 ghij DEFGH HS 84.33 defgh CDEFGH HS

59 小叶黄 80.67 hijk DEFGH HS 84.67 defgh CDEFGH HS

60 小黄烟 76.00 ijkl EFGHI MS 94.67 abc ABC HS

22 温德尔 74.67 jklm FGHI MS 67.33 jkl IJKLM MS

14 优选1号 73.34 jklm GHI MS 68.00 jkl IJKLM MS

20 Vesta64 72.67 jklm GHI MS 53.33 mn NOPQ R

19 湄潭烤烟 72.67 jklm GHI MS 64.00 l KLMN MS

17 三道1号 71.34 klm HI MS 62.67 l LMNO MS

13 土耳其雪茄 66.00 lmn IJ MS 66.67 kl JKLM MS

21 金星6007 65.34 mno IJ MS 65.34 kl JKLM MS

16 桦甸柳叶尖 58.00 nop JK R 64.25 l KLMN MS

15 二青杆 57.33 nop JKL R 52.00 mn OPQ R

23 云87 56.67 nopq JKL R 52.00 mn OPQ R

18 黑苗2645 55.34 opq JKLM R 60.00 lm MNOP R

11 永定1号 55.34 opq JKLM R 59.33 lm MNOP R

12 K730 52.00 pqr KLMN R 59.33 lm MNOP R

4 无名雪茄 50.00 pqrs KLMNO R 42.67 op QRS R

9 广东56号 46.67 qrst KLMNOP R 48.25 no PQR R

3 中烟90 46.67 qrst KLMNOP R 45.33 nop QR R

7 Y8190 46.67 qrst KLMNOP R 36.67 pq RS R

6 Y101 44.00 rst LMNOPQ R 41.33 opq QRS R

5 Y106 42.67 rstu MNOPQ R 42.00 opq QRS R

1 春雷1号 40.67 stuv NOPQ R 46.00 no QR R

10 Xanthi-nc 37.45 tuv OPQ R 33.33 qr ST R

8 净叶黄 34.00 uv PQ R 44.67 nop QRS R

2 九楼烟 32.67 v Q R 33.33 qr ST R

注：小写字母不同表示差异显著（P<0.05），大写字母不同表示差异极显著（P<0.01）。

Note： Lower case letters indicate significant difference at 0.05 level（P<0.05）， upper case letters indicate significant difference at 0.01 level（P<0.01）.

.

3 讨 论

烟草菌核病在我国烟叶生产中一直被认为是次要病害，尚未造成较大危害。经2010—2014年烟草有害生物调查发现，烟草菌核病在吉林省延边烟区危害呈上升趋势，初步分析可能与品种抗性有关。后经接种测试表明，延边烟区主栽品种吉烟九号苗期对菌核病表现为高感。本研究于2015年首次对分离自吉林省延边烟田内的烟草菌核病病原菌进行形态学、rDNA-ITS序列比对及基于rDNA-ITS序列构建系统发育树，明确该病原菌为核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]。据 报道，核盘菌除引起烟草菌核病外，还可引发大白菜、向日葵、大豆等多种作物菌核病[2]，吉林省延边州大田作物以玉米、大豆、十字花科蔬菜为主，表明在田间自然条件下存在着大量菌核病侵染源，烟草轮作种植时考虑前茬作物种类，在一定程度上可预防烟草菌核病的发生。

种植抗病品种是防治病害最经济、有效的方法，抗性种质材料是选育抗病品种的基础。近年来，烟草抗病资源筛选工作已经在烟草病毒病[18-19]、烟草青枯病[20-21]、烟草黑胫病[22-23]方面取得了显著进展，烟草菌核病抗性鉴定方法及抗病资源筛选国内尚未见报道。一般情况下，烟草菌核病菌主要为害烟株茎部、叶片及蒴果，茎部、蒴果人工接种较叶片操作繁琐，耗时多、显症时间长；离体叶片法、活体叶片法已在黄瓜[12]、向日葵[13]、花椰菜[14]、马铃薯[15]、水稻[16]等多种作物抗病资源筛选（鉴定）上成功应用。本研究同时采用离体叶片法、活体叶片法进行菌核病抗性研究，能更准备、更客观的鉴别烟草种质材料对菌核病的抗性。试验中筛选出15份抗性种质材料，占全部供试材料的24.59%，说明抗性种质在现有烟草种质材料中占一定比例，为后续抗病育种及抗病有关遗传信息研究提供理论依据。在统计种质材料抗（感）情况时发现，离体叶片法接种的种质材料病情指数高于活体叶片法，且有9份鉴定结果不一致，均相差1个抗性等级，分析可能是叶片离体后，其生理代谢活动降低引发抗性下降所致。

苗期抗性鉴定与成株期田间抗性鉴定相比，具有省工省时，环境溫、湿度条件易控制等优点，可将其作为种质材料抗性鉴定的初步研究。然而，种质材料抗性的最终评价，需结合成株期田间抗性鉴定结果。

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