实时荧光定量PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒

谷宇佳

[摘要] 目的 对疑似甲型H1N1流感病毒携带者的标本进行病毒核酸确诊，进而探讨实时荧光定量PCR技术在甲型H1N1流感病毒检测诊断中的意义。方法 选取2017年9—12月某院检验科工作人员采集的330份疑似甲型H1N1流感病毒携带者咽拭子标本，对其进行病毒核酸确诊检测，根据检测结果对甲型H1N1流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒以及乙型流感病毒进行临床分型。结果 该组标本中检出甲型H1N1流感病毒核酸阳性标本108份，检出率为108/330（32.73%），检出甲1型流感病毒10份（3.03%），检出甲3型流感病毒21份（6.36%），未检出乙型流感病毒。结论 临床上诊断甲型H1N1流感病毒时，采用实时荧光定量PCR技术，此种技术操作简单、快速、有着较强的特异性和较高的灵敏度。有着较高的应用价值。

[关键词] 实时荧光定量PCR技术；检测；甲型H1N1流感病毒

[中图分类号] R446.5 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2018）11（a）-0035-02

甲型H1N1流感病毒是一种甲型流感病毒，临床上对其进行检测时，传统的方法是以细胞培养或者鸡胚培养分离定型流感病毒，但是这些方法都需要耗费较长的时间，尤其满足不了暴发疫情时，对病毒的诊断需求。近些年，随着医疗技术的发展，实时荧光定量PCR技术被广泛的应用在了检测甲型H1N1流感病毒的临床上，此种技术操作起来极其简单快捷，并且其灵敏度和自动化的程度比较高，加上对核酸有着较高的扩增性，能够对甲型H1N1流感病毒做出快速的检测[1]。为了对实时荧光定量PCR技术在甲型H1N1流感病毒检测诊断中的意义进行更加深入的探讨，2017年9—12月该文选取了330份疑似甲型H1N1流感病毒携带者咽拭子标本，对其进行病毒核酸确诊检测后，根据检测结果对标本进行了临床分型。现对详细内容做如下报道。

1 资料与方法

1.1 标本的采集和处理

选取某院检验科工作人员采集的330份疑似甲型H1N1流感病毒携带者咽拭子标本，其中包括某院儿科门诊、内科门诊、以及呼吸科病房中发热伴咳嗽、咽痛等疑似甲型H1N1流感病毒携带者的咽拭子标本。该次研究中涉及到的标本的采集、存储、运输等各项操作均以《甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案（试行）》文件为依据进行执行，将采集到的标准送至实验室进行检测，检测人员要在规定的时间内完成检测，对于来不及检测的标本，应将其放置在-70℃的环境下进行冻存。

1.2 仪器与试剂

该次研究中用到的仪器为Ⅱ级生物安全柜（生产企业：美国NuAire NU公司；型号：425-400E）；冷冻离心机（生产企业：美国贝克曼Microfuge公司；型号：22R）；全自动实时荧光定量PCR仪（生产企业：美国ABI公司；型号7500 fast）；旋涡振荡器（生产企业：德国Heidolph公司）；核酸提取盒【生产企业：德国QIAGEN公司；型号：RNeasy Mini Kit】；无核酸离心管；甲型H1N1流感病毒（2009）RNA检测试剂盒（生产企业：北京金豪公司）。

1.3 对标本中的病毒进行提取

采用核酸提取盒对标本中的病毒RNA进行提取，提取操作严格按照试剂盒中的使用说明书进行。

1.4 反应的体系以及条件

采用甲型H1N1流感病毒（2009）RNA检测试剂盒。反应体系包括：SWH1反应液、逆转录酶，注意所有反应体系的配置情况均以试剂的说明书为依据进行。反应条件：逆转录以变性为，在50℃下进行30 min，然后在95℃下进行3 min，按照次顺序进行1个循环，预扩增为在95℃下进行15 s，然后在50℃下进行30 s，在72℃下进行1 min，按照此顺序进行5个循环，再在95℃下进行10 s，在55℃下进行40 s，按照此顺序进行40个循环，最后为荧光收集，选取FAM信道在55℃的环境下进行单点荧光检测。

2 结果

2.1 RT-PCR技术的特异性与敏感性

采用实时荧光定量PCR技术对甲1型流感病毒、甲3型流感病毒以及乙型流感病毒的RNA样本进行检测，这样也能够排除甲型H1N1流感病毒的可能性。对本院检验科人员所提取的甲型H1N1流感病毒RNA的检测过程中，特异性引物和探针对检测结果起到了辅助性的作用。

2.2 对疑似流感标本的检测结果

该组标本中检出甲型H1N1流感病毒核酸阳性标本108份，检出率为108/330（32.73%），检出甲1型流感病毒10份（3.03%），檢出甲3型流感病毒21份（6.36%），未检出乙型流感病毒。详见表1。

对该次检测结果进行分析后发现，甲型H1N1流感病毒阳性率逐渐降低，疫情基本处于稳定状态，并且越进入冬季，所检测出来的流感样病理基本都是甲型H1N1流感病毒。

3 讨论

定量实时PCR技术是美国Applied Biosystems公司在1996年研发出来的一种新技术，此种技术不但能够解决PCR污染的问题，还具有较高的自动化程度以及较强的特异性[2]。采用此种技术对甲型H1N1流感病毒进行检测诊断时，由于将实时PCR技术与逆转录技术结合了起来，因此被叫做定量“RT-PCR”技术。结合起来的这种技术能够用少量的RNA识别出在某个特定时间、细胞以组织内的特定基因，将此种技术应用在检测甲型H1N1流感病毒检测诊断的临床上，为提高诊断准确性提供了可靠的依据[3]。

根据国家对甲型H1N1流感病毒检测诊断的标准以及处理原则，对流行性感冒病原学常规的检测方法为病毒培养法，这种方法虽然也有着较高的诊断准确率，但是确诊时间一般在15～20 d，并且还会受到实验室条件和人员条件的限制。而定量实时PCR技术检测法不但灵敏度高，操作方便，最主要的是耗时短，整个检测过程只需要3～4 h就可以完成，尤其在甲型H1N1流感病毒爆发的季节，此种方法是最为有效的检测手段[4]。

实时荧光定量PCR技术是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测来实现了对起始模板定量以及定性的分析，在这个扩增反应中，将荧光化学物质引入其中，荧光强度的信号会随着扩增反应的进行而逐渐加强，此时所监测到的信号就可以绘制成一条曲线，然后对未知模板进行定量分析。在实际检测的过程中，既有特异性引物存在，还有核苷酸探针存在，其目的都是在进行扩增反应时，利用聚合酶的活性将探针进行水解，使其水解成单核苷酸，此时有力的荧光报告基因导致的荧光信号的增加，就会通过荧光信号强度进行的实时动态进行检测，从而达到对扩增反应产物进行定量的分析[5]。

该次研究中，选取了2017年9—12月某院检验科工作人员采集的330份疑似甲型H1N1流感病毒携带者咽拭子标本，采用定量实时PCR技术对其进行病毒核酸确诊检测后结果显示，该组标本中检出甲型H1N1流感病毒核酸阳性标本108份，检出率为108/330（32.73%），检出甲1型流感病毒10份（3.03%），检出甲3型流感病毒21份（6.36%），未检出乙型流感病毒。并且在进入11月份和12月份后，甲型H1N1流感病毒的检出率逐渐降低。在9月份开始，各学校已经开学，这种聚集性的环境非常有利于甲型H1N1流感病毒的传播和扩散，进入11月后，气温逐渐转变凉，甲型H1N1流感病毒的阳性率逐渐下降，这可能是由于进入冬季后，人们的个人预防意识增强，加上甲型H1N1流感病毒疫苗的广泛注射，阳性率有所降低。

综上所述，临床上诊断甲型H1N1流感病毒时，采用实时荧光定量PCR技术，此种技术操作简单、快速、有着较强的特异性和较高的灵敏度，建议将此种检测技术应用在更多的临床上。

[参考文献]

[1] 纪衍瑾，孙雯雯，朱喆.定量实时PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒[J].中国民康医学，2015，27（17）：61-62.

[2] 方盛藩，郑夔，李小波，等.甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR标准阳性模板的构建[J].中国卫生检验杂志，2015， 25（1）：1-3.

[3] 尹航，杨焕良，陈艳，等.甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2013，35（1）：36-39.

[4] 陈棋炯，孙永祥，丁水军，等.应用实时荧光定量PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒[J].中国卫生检验杂志，2010，20（6）：1394-1396.

[5] 尹惠琼，刘松婷，史利军，等.甲型H1N1流感病毒核酸熒光定量RT-PCR检测技术[J].生物技术通讯，2010，21（2）：244-247.

（收稿日期：2018-08-01）