温度胁迫下烟粉虱MED隐种与亚洲Ⅱ3隐种三个抗寒基因表达模式的分析

申晓娜　吕志创　李有志　刘万学　万方浩

摘要

烟粉虱Bemisia tabaci具有强的温度耐受性，但烟粉虱入侵种MED隐种与本地种亚洲Ⅱ3隐种在我国的地理分布上存在巨大的差异。因此本研究以烟粉虱MED隐种和亚洲Ⅱ3隐种为研究对象，采用qRTPCR技术分别检测两种烟粉虱3个抗寒基因（erythrocyte binding protein， trehalase，dopadecarboxylase）在5个梯度温度胁迫下mRNA水平上的相对表达量，分析其在高低温胁迫过程中表达量的变化，探索抗寒基因在烟粉虱MED隐种成功入侵并广泛分布于各气候区域中所起的作用。研究结果表明这两种烟粉虱隐种体内，3个抗寒基因均显著受低温诱导。但相对于AsiaⅡ3隐种，低温胁迫下烟粉虱MED隐种体内的3种抗寒基因能更快速地做出响应，且基因上调或下调的量也相对较多。

关键词

烟粉虱； 温度胁迫； 抗寒基因； qRTPCR； 定量表达

中图分类号：

S 433.3

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017189

Comparative analysis of the expression patterns of three coldresistant gene in

MED and Asia Ⅱ3 cryptic species of Bemisia tabaci under temperature stress

SHEN Xiaona1，2， L Zhichuang2， LI Youzhi1， LIU Wanxue2， WAN Fanghao2

（1. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China；

2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant

Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Bemisia tabaci has strong temperature tolerance （heat resistance and cold resistance）. However， there were significant differences in the distribution of invasive species （MED cryptic species） and native species （Asia Ⅱ 3 cryptic species） in China. Therefore， in this study， we used qRTPCR to detect the mRNA relative expression level of 3 important coldresistant genes encoding the erythrocyte binding protein， trehalase and dopadecarboxylase in the two B.tabaci cryptic species under the stress of five gradient temperatures. The purpose of the study is to explore the roles of coldresistant genes in the successful invasion of B.tabaci MED cryptic species and widespread distribution in different climatic regions by analyzing the change of the relative expression level. The results of qPCR test showed that three coldresistant genes were significantly induced by low temperature in the two B.tabaci cryptic species. Compared with the Asia Ⅱ 3 cryptic species， B.tabaci MED could make adjustments to adapt to the lowtemperature environment more quickly， and the adjustment level was also relatively higher. Therefore， we speculate that it may be one of the important mechanisms that makes MED cryptic species invade into a wide range of cold regions and adapt quickly to survive.

Key words

Bemisia tabaci； temperature stress； coldresistance gene； qRTPCR； quantitative expression

煙粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）属半翅目Hemiptera，粉虱科Aleyrodidae，是一个包含 36 个以上隐种的物种复合体[14]，其中烟粉虱 MED （Mediterranean）（Q型）隐种起源于地中海，入侵性强，随着世界范围内的贸易往来，该隐种借助花卉及其他经济作物的苗木迅速扩散，在世界各地广泛传播并暴发成灾。2003 年，在中国云南昆明首次发现烟粉虱 MED 隐种[5]，现几乎分布于全国各个省市[3]，包括位于我国东北严寒地区的诸多省市。而亚洲Ⅱ3隐种在我国自然分布的区域要相对小很多，目前仍然仅分布在广东、台湾、浙江、湖南、湖北[67]，且没有向其他地域扩散的趋势。因此，我们推测烟粉虱的抗寒能力是导致它们分布不同的重要原因之一，本研究通过测定抗寒基因在温度胁迫下表达量的差异来探索抗寒能力对入侵种和本地种烟粉虱分布的影响。

昆虫抗寒性物质包括两类， 即小分子的物质和抗冻蛋白（antifreeze proteins， AFPs）。目前已知的小分子抗寒性物质有甘油、山梨醇、甘露醇、五碳多元醇（可能是阿拉伯糖醇或核酸醇）、海藻糖、葡萄糖、果糖以及某些昆虫体内的氨基酸和脂肪酸。不同昆虫积累的物质种类和含量是不同的， 但大多数昆虫都由几种抗寒物质构成一个物质系统[8]。其中海藻糖作为昆虫的血糖，具有对热、冷、营养缺乏、缺水、氧化试剂等多种不良刺激的耐受性[910]，能够保护生物膜的完整性和维持生物活性，从而保护细胞免受冻伤[11]。Ueno 等[12]研究发现果蝇在遇到寒冷环境时，代谢率会提高，并且多巴胺含量有变化，表明多巴胺对果蝇行为变化的影响具有温度敏感性。而erythrocyte binding protein富含多种氨基酸，可作为氨基酸的代表对昆虫抗寒性进行研究。此外在异色瓢虫体内也对这些小分子物质进行了初步的研究，研究结果表明这三种物质确实在异色瓢虫抵御寒冷环境中起到作用[13]。

为了更好地理解烟粉虱的温度抗逆能力，本试验从微观层面找到烟粉虱这三个具有代表性的抗寒关键基因，采用qRTPCR技术分别检测烟粉虱MED隐种和亚洲Ⅱ3隐种两个种型体内3个重要抗寒基因在短时高低温胁迫下mRNA水平上的相对表达量，有研究显示在低于-5℃和高于45℃的温度胁迫条件下，两种烟粉虱存活率开始显著降低，即在-5～45℃的温度胁迫下这两种烟粉虱均能正常存活，尚未达到其极端致死温度[14]，因此本试验选择0、12、35、40℃4个温度梯度对其进行胁迫处理，26℃下做相同处理作为对照。分析其在抵御温度胁迫时所起的作用，以及对比两种烟粉虱体内表达量的差异，探索烟粉虱MED隐种成功入侵的原因。期望为进一步研究烟粉虱的温度适应机制和制定可持续控制烟粉虱危害的方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

采用的烟粉虱 MED 隐种为中国农业科学院植物保护研究所生物入侵研究室饲养种群，亚洲Ⅱ3隐种为2016年在广东偶然采得，带回室内于番茄苗上饲养并通过COI的方法鉴定其生物型为亚洲Ⅱ3隐种，并在室内饲养种群，均以番茄Lycopersicum esculentum Mill （‘中杂九号）为寄主植物饲养，无用药史，温室饲养温度为（26±1）℃，相对湿度 60%～80%，光周期为L∥D=16 h∥8 h。

1.2 仪器及试剂

1.2.1 主要仪器

Implen超微量紫外可见分光光度计（NanoPhotometer TM PClass）、高低温控温设备（K6CCNR，德国Huber）、台式低温离心机（艾本德）、实时荧光定量 PCR 仪（7500型）（美国ABI公司）、普通 PCR 仪、电泳仪、琼脂糖凝胶电泳成像系统均为美国 BioRad 公司的产品。

1.2.2 主要试剂

实时荧光定量PCR试剂和耗材盒购自美国BioRAD公司、RNA 提取试剂Trizol Regent 购自 Invitrogen 公司；反转录试剂盒（Super Script FirstStrand Synthesis System）、TransStartTaq DNA Polymerase 及 PCR 相关试剂（dNTPs mix、10×TransStartTaq Buffer）、引物合成与产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.3 试验方法

1.3.1 低温胁迫处理

每个隐种各取200头成虫于1.5 mL离心管中，置于低温（0、12℃）和高温（35、40℃）环境中分别进行胁迫处理1、3、5 h，室温26℃作为对照，每个处理做3个生物学重复。处理结束后立即液氮冷冻5 min，于-80℃保存。

1.3.2 抗寒基因的引物设计与合成

选择EF1α、βtub两个基因作为内参基因，其在烟粉虱体内表达稳定，特异性强[13]，且研究证明选择一个内参基因易使表达分析出现较大误差，选择两个内参基因进行相对定量试验可获得更为准确、可信度更高的试验结果。根据本实验室前期烟粉虱转录组分析得到的数据，确定erythrocyte binding protein、trehalase、dopadecarboxylase 3个基因为潜在的抗寒关键基因，利用Primer Premier 5.0设计，Oligo软件分析定量引物，具体见表 1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 总RNA 的提取及cDNA第一链的合成

将胁迫处理过的200头烟粉虱成虫提取总RNA，采用Trizol（Invitrogen，USA）一步法进行提取，采用紫外比色和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA 的纯度和完整度。根据荧光定量标准曲线结果确定将其定量为1 000 ng（反转录后可通过分光光度计检测cDNA浓度微调其含量至1 000 ng），采用Super Script FirstStrand Synthesis System 试剂盒进行反转录合成第一链cDNA，并于-20℃保存备用。

1.3.4 实时荧光定量 PCR

实时荧光定量PCR试验体系： Mix 10 μL，染料0.4 μL，引物F（10 pmol）0.4 μL，引物R（10 pmol） 0.4 μL，cDNA模板1 μL，补充DEPC水至20 μL。反应程序：94℃ 50 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环，绘制65～95℃熔解曲线。除生物学重复外，每个胁迫处理得到的cDNA模板做3个技术重复以减小试验误差。

1.3.5 数据统计分析

通过定量 PCR 测定出5個基因（包含内参）的 CT 值，取3个技术重复CT值的平均值进行数据统计分析（数值相差在 0.5 以内可用，3 个数值中有 2 个或 3个接近，数值可用，否则重做）。使用2-ΔΔ CT法进行计算，2-ΔΔ CT计算公式[16]：2-ΔΔ CT=2-[（CT 对照组-CT对照组（内参））-（CT 待测组-CT待测组（内参））]。

采用SPSS13.0软件（SPSS Inc.， USA）进行数据分析，Oneway ANOVA 进行数据差异性分析，显著性检验水平均为P≤0.05。

2 结果

2.1 高低温胁迫下抗寒基因表达分析

对前期转录组筛选获得的3个重要抗寒基因进行实时荧光定量 PCR，各隐种对照组测定的基因表达量定为1，分析处理组的相对表达量。根据方差分析结果制作柱形图，比较高低温胁迫过程中两个隐种体内同一基因的表达变化趋势，分析两个隐种之间，同一基因在相同胁迫处理下表达的差异。

2.1.1 Erythrocyte binding protein基因表达分析

2.1.1.1 不同温度胁迫下Erythrocyte binding protein基因相对表达量的变化趋势

低温胁迫5 h内，两个隐种体内erythrocyte binding protein基因的表达均发生上调（图1a，1b）；在高温胁迫5 h内，两个隐种体内erythrocyte binding protein基因的表达趋势基本一致，均先上调后下调（35℃胁迫处理下，仅入侵种MED隐种发生了显著的变化，如图1a，1b）。

2.1.1.2 相同胁迫条件下烟粉虱两个隐种体内Erythrocyte binding protein基因相对表达量的对比分析

由2.1.1.1结果可知低温胁迫下两个隐种体内erythrocyte binding protein基因的表达均发生上调，但通过两者的对比分析，我们发现在烟粉虱MED隐种体内，erythrocyte binding protein基因仅在胁迫1 h时就发生了显著的上调，而亚洲Ⅱ3隐种在胁迫3 h时才出现了上调，且上调的相对表达量低于烟粉虱MED隐种1 h时的表达量，如图2a，2b；高温胁迫下则无此现象发生，如图2c，2d。

2.1.2 Trehalase基因表达分析

2.1.2.1 不同温度胁迫下trehalase基因相对表达量的变化趋势

低温胁迫5 h内，两个隐种体内trehalase基因表达均下调，如图3a，3b；在高温胁迫5 h内，两个种群体内trehalase基因的表达趋势基本一致，均发生一定的下调，如图3a，3b。

2.1.2.2 相同胁迫条件下烟粉虱两个隐种体内trehalase基因相对表达量的对比分析

与erythrocyte binding protein基因相同的是烟粉虱MED隐种体内的trehalase基因在胁迫1 h时发生了显著的下调，而亚洲Ⅱ3隐种在胁迫3 h时才出现了下调，且下调的相对表达量低于烟粉虱MED隐种1 h时的表达量，如图4a，图4b；高温胁迫下则无此现象发生，如图4c，4d。

2.1.3 Dopa decarboxylase基因表达分析

2.1.3.1 不同温度胁迫下Dopa decarboxylase基因相对表达量的变化趋势

低温胁迫5 h内，两个隐种体内dopa decarboxylase基因的表达均先上调后再发生下调（图5a，5b）。在高温胁迫5 h内，两个隐种体内dopa decarboxylase基因的表达趋势也基本保持一致，均发生一定的上调（5a，5b）。

2.1.3.2 相同胁迫条件下烟粉虱两个隐种dopa decarboxylase体内相对表达量的对比分析

与前两者不同的是低温胁迫5 h内，dopa decarboxylase基因发生上调的时间基本一致，再发生下调时间与erythrocyte binding protein、trehalase基因的规律是一致的，即烟粉虱MED种群体内dopa decarboxylase基因在3 h就开始下调，而亚洲Ⅱ3隐种则需在5 h才开始下调；而且相对于本地种（亚洲Ⅱ3隐种），入侵种（烟粉虱MED隐种）能更快速地做出调节来适应低温环境，如图6a，6b；高温胁迫下则无此现象发生，如图6c，6d。

3 讨论

低温胁迫是对昆虫耐寒性的检验，昆虫耐寒性是对低温环境长期适应中通过本身的遗传变异和自然选择获得的一种适应性。短时低温胁迫是指昆虫在较短时间内承受突然降温带来的冲击，并对其产生反应，短时低温胁迫并不是极端寒冷下的耐寒能力，而是在 0℃左右开始被激发，这与季节性低温胁迫及长期低温胁迫完全不同。短时低温胁迫时，细胞膜和细胞器最先受到损害，低温使其膜结构改变，流动性变差，失去渗透性，并导致离子的重新组合[17]，还会损伤线粒体的功能。在昆虫生长发育的各个时期，均有短时低温胁迫的发生，此方面的报道最早来自红尾肉蝇Sarcophaga crassipalpis、榆叶甲Xanthogaleruca luteola、乳草蝽 Oncopeltus fasciatus[1819]，目前已经对弹尾目[20]、鞘翅目[21]、双翅目[2223]、半翅目[24]、缨翅目[25]以及蜱螨亚纲[2637]进行了研究。例如在鳞翅目的幼虫至成虫均有短时低温胁迫的发生，甚至是卵期，且不同昆虫种类及发育阶段条件下快速低温胁迫产生的效应是不同的。而短时高温胁迫也能协助了解基因在环境胁迫下的变化，从而更完整地掌握许多与温度调控相关基因的调控机制。

烟粉虱MED隐种是世界上危害最大的入侵物种之一，在入侵过程中对中国以及其他多个国家和地区的许多农作物造成毁灭性危害。一项在中国和澳大利亚完成的研究揭示，这一害虫的交配行为能帮助其入侵土著烟粉虱种群的领地，将危害性不大的土著烟粉虱灭绝并予以取代[28]。所以了解入侵机制对害虫管理很重要，因为这能帮助研究人员就外来害虫入侵以及取代土著近缘生物的范围和速度作出准确预警。近几年来，在我国东北逐渐发现烟粉虱MED隐种的危害，说明该物种正在适应更低的气温逐渐向我国北部严寒地区入侵，而我国本地种亚洲Ⅱ3隐种，目前仍仅存在于浙江、广州一带[67]，没有向其他地区扩散的趋势，因此，研究烟粉虱耐寒機制对研究其入侵机制至关重要，研究两个隐种之间的差异表达对探索烟粉虱MED隐种如何成功入侵有很大的帮助。在抵御外界逆境时，热激蛋白、TRP等基因[2930]会通过调节昆虫体内某种物质含量从而抵御多种逆境，因此本研究也通过短时高温胁迫来了解这3种基因在短时高温下表达量的变化趋势，从而帮助我们完整地了解3种抗寒基因在调控温度适应机制时所产生的具体作用。

前期研究发现热激蛋白（heatshock proteins，HSPs）在抗寒过程中发挥着重要的功能，除了热激蛋白对抗寒过程具有调控作用外，本研究发现一些激素类物质合成和降解的基因也在烟粉虱抗寒过程中发挥着作用，如dopa decarboxylase、trehalase和erythrocyte binding protein。海藻糖作为昆虫的血糖，具有对热、冷、营养缺乏、缺水、氧化试剂等多种不良刺激的耐受性[910]，能够保护生物膜的完整性和维持生物活性，从而保护细胞免受冻伤[11]。本试验发现烟粉虱入侵種和本地种的海藻糖酶基因一直在调控整个高低温胁迫过程（图3），表明海藻糖酶基因能够通过控制烟粉虱的海藻糖含量来调控其抗逆过程。Ueno 等[12]研究发现果蝇在遇到寒冷环境时，代谢率会提高，并且多巴胺含量有变化，表明多巴胺对果蝇行为变化的影响具有温度敏感性。本试验中，多巴脱酸酶基因明显表达调控烟粉虱入侵种整个抗寒过程（图4），这说明多巴胺确实在烟粉虱MED隐种抵御寒冷环境中起到一定的作用。此外，本研究发现erythrocyte binding protein基因在烟粉虱两个隐种的整个抗逆过程中也发挥了重要的作用。对比抗寒基因在两个隐种体内表达的异同，发现短时低温胁迫下，两个隐种体内的三个抗寒基因均受低温诱导，相对于本地种（亚洲Ⅱ3隐种），入侵种（烟粉虱MED隐种）能更快地对低温环境做出响应，推测其能调控相关抗寒物质含量来抵御低温环境，进一步推测这可能是其能快速适应不同气候环境的重要机制之一。而在短时高温胁迫下，抗寒基因在两个隐种体内发挥了相似的作用，即能受高温诱导做出响应，推测其能适当调控高温带来的损伤。

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（责任编辑：田 喆）