异养硝化－好氧反硝化菌的研究进展

要如磊

（阳泉煤业（集团）有限责任公司太原化工新材料有限公司,山西 太原 030400）

引 言

近年来,氮素污染所导致的水体富营养化已经引起了人们的广泛关注,废水脱氮研究尤为迫切。目前,生物脱氮工艺以其操作简单、成本低、二次污染小、脱氮效率高等多方面的优点,在国内外污水处理中被广泛应用。传统生物脱氮包括好氧条件下的自养硝化过程和厌氧条件下的异养反硝化过程,分别由硝化菌和反硝化菌完成。硝化反应与反硝化反应对溶解氧浓度需求的不同导致好氧区和缺氧区的分开,二者在反应器上难以统一。

然而,随着研究的深入,近年来人们发现有些脱氮微生物兼具异养硝化和好氧反硝化的功能,异养硝化－好氧反硝化菌成为生物脱氮领域内的一个新的热点。这些新型脱氮微生物可以使硝化和反硝化反应能在同一反应器内同时完成,节省了反应空间,缩短了反应时间,平衡了反应条件,还克服了传统生物脱氮存在的很多弊端。

1 异养硝化－好氧反硝化菌的类型

1983年,荷兰Robertson和Kuenen最早从脱硫脱氮污水处理系统中分离出一株泛养硫球菌thiosphaera pantotropha（后更名为脱氮副球菌paracoccus denitrificans）,随后发现它能同时进行异养硝化和好氧反硝化,其功能的特殊性吸引了国内外学者对异养硝化－好氧反硝化菌广泛而深入的研究。

1989年,Robertson和Cornelisse对delft菌种保藏库中某些异养硝化菌是否为好氧反硝化菌进行了研究。结果表明,具有异养硝化功能的脱氮假单胞杆菌pseudomonas denitrificans和粪产碱杆菌alcaligenes faecalis也具有好氧反硝化功能。

近十几年来,国内外学者积极研究,新的异养硝化－好氧反硝化菌不断被发现,大大拓宽了双功能菌的种类。异养硝化－好氧反硝化菌主要存在于副球菌属（paracoccus）、假单胞菌属（pseudomonas）、产碱杆菌属（alcaligenes）、芽孢杆菌属（bacillus）、红球菌属（rhodococcuus）等（见第33页表1）。

2 异养硝化－好氧反硝化菌的筛选方法

2.1 选择性培养基法

利用不同氮源的选择性培养基可以用来筛选异养硝化－好氧反硝化菌。首先,通过氨氮培养基初筛得到异养硝化菌,挑选氨氮去除能力较高的菌株；然后,将其接种于硝酸氮培养基进行复筛,最终得到异养硝化－好氧反硝化菌。Zhang［1］等先用硝化基础培养基富集、分离、纯化得到异养硝化菌,然后用反硝化培养基筛选出能利用NO－3、NO－2的菌株,从猪粪废水中筛选得到YZN－001菌株。此菌株不仅能利用氨氮,而且能利用硝酸氮。

2.2 酸碱指示剂法

溴百里酚蓝（BTB）指示剂的变色范围为6.0～7.6,由黄色经绿色变为蓝色。而反硝化作用消耗硝酸盐或亚硝酸盐后,OH－不断积累,根据反硝化过程产碱这一特性在反硝化培养基中加入BTB,筛选平板上出现蓝色晕圈的菌落,即可实现好氧反硝化菌的初步筛选。尹明锐［2］等利用BTB培养基分离得到好氧反硝化菌,进一步通过硝化测定,选取氨氮去除率在50%以上的菌株,确认得到3株异养硝化－好氧反硝化菌。

表1 新型异养硝化－好氧反硝化菌

而另一些研究者同样利用溴百里酚蓝指示剂的变色特点,先筛选得到异养硝化菌,进一步接种于含有1%BTB的反硝化培养基,能使培养基变蓝,并且杜氏小管中有气泡生成的菌株同时具有好氧反硝化作用。

2.3 滴加试剂法

格里斯试剂遇会变红,二苯胺试剂遇会变蓝,纳氏试剂遇会变红,该方法利用显色反应筛选出目标菌。培养一段时间后,在硝化培养液中加入1滴～2滴格里斯试剂,如溶液立即呈粉红色或棕色等,则表示氨氮转化为亚硝酸氮,说明培养液中有硝化菌存在；进一步加入纳氏试剂,培养液为无色,则表示氨氮转化完全。同上方法,滴加格里斯试剂检测反硝化培养液中是否有反硝化菌；进一步加入二苯胺试剂,若无色,则表示硝酸盐转化完全。蒋静艳［3］等以乙酰胺为唯一碳氮源进行培养得到初筛菌,用格里斯试剂和二苯胺试剂验证是否为硝化菌。袁梦冬［4］等将筛选得到的异养硝化菌接种至硝酸盐还原培养基中,连续3d取样滴加二苯胺试剂、格里斯试剂、纳氏试剂,菌株的硝酸盐还原实验呈阳性,初步断定该菌株同时具有异养硝化和好氧反硝化作用。

2.4 测试验证法

另外,研究者还可以对已获得的菌株进行硝化或反硝化能力测试,验证其是否为异养硝化－好氧反硝化菌。Hung－Soo Joo［5］等对从污水中分离得到的异养硝化菌alcaligenes faecalis No.4进行探究,结果表明,被去除的氨氮中50%发生了反硝化,其既有硝化功能,也有反硝化功能。Joong Kyun Kim［6］等对24株芽孢杆菌经过异养硝化、好氧反硝化验证,最终筛选出5株具有好氧反硝化功能的异养硝化菌。

选择性培养基法筛选菌株准确,但涉及多次涂板、划线,工作量大,筛选时间长；酸碱指示剂法筛选菌株准确,颜色变化明显,操作方法简单,分离快速高效；滴加试剂法筛选方法不准确,因为整个硝化、反硝化过程中、的积累量较少或没有,加入格里斯试剂和二苯胺试剂呈阴性反应,并不能说明该菌株不具有硝化能力,容易漏筛目标菌；测试验证法适合验证某种已获得菌株是否具有硝化、反硝化功能,并不适合异养硝化－好氧反硝化菌的直接筛选。

3 异养硝化－好氧反硝化菌的脱氮性能

目前,已经发现的异养硝化－好氧反硝化菌的脱氮性能较高。Taylor Shauna M［7］等从膜生物反应器中筛选得到一株雷氏普罗威登斯菌providencia rettgeri YL,在最优条件（C/N 10,30℃,120r/min）下,当氨氮质量浓度为84.63mg/L时,接种该菌48h后TN（总氮）去除率为79%。Zhao Bin［8］等对异养硝化－好氧反硝化菌bacillus sp.LY进行好氧脱氮性能研究。结果表明,在C/N 15、30℃最优条件下,当初始氨氮质量浓度为40mg/L时,最大氨氮去除效率可达到100%,TN去除效率可达78.9%。

大量研究表明,异养硝化－好氧反硝化菌在转化氨氮为气态氮化物的同时,还利用氮源发生同化作用,转化为菌株细胞内的含氮有机化合物。Hung－Soo Joo 等 研 究 高 浓 度 氨 氮 下 alcaligenes faecalis No.4的脱氮效率,当初始质量浓度高达1 200mg/L时,接种菌株93h后,几乎所有氨氮被去除。其中,50%转化为细胞内含氮物质,3%转化为硝化产物,40%～50%发生反硝化作用。GC－MS证明90%的反硝化产物为氮气。Chen Qian［8］等对农杆菌agrobacterium sp.LAD9在异养硝化－好氧反硝化过程中的氮平衡进行研究,TN初始质量浓度为97.19mg/L。接种该菌24h后,50.1%的 TN被转化为气态氮化物,40.8%的TN转化为生物量。由此可见,异养硝化－好氧反硝化菌的生物同化作用成为限制总氮去除率的一个主要原因。

4 总结与展望

综上所述,异养硝化－好氧反硝化菌的属种范围逐步扩大,筛选方法日益成熟,脱氮效率可达到50%～80%。新型异养硝化－好氧反硝化菌能利用多种无机氮源,减少反应器数量,减小外加碱量,降低成本,在污水处理方面应用前景广泛。但是,异养硝化－好氧反硝化菌的总氮去除效率仍然较低,将菌株固定化、提高微生物浓度、实现菌种的固液分离和回收,对提高脱氮效率有非常重要的意义。

参考文献：

［1］ Zhang Jibin,Wu Pengxia,Hao Bo,et al.Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by the bacterium［J］.Bioresource Technology,2011（102）：9866－9869.

［2］ 尹明锐,汪苹,刘健楠,等.具有N2O控逸能力的异养硝化－好氧反硝化菌株的筛选鉴定［J］.环境科学研究,2010,23（4）：515－520.

［3］ 蒋静艳,胡正华,黄耀.异养硝化－好氧反硝化菌的分离鉴定及其在不同培养条件下产N2O研究［J］.环境科学,2009,30（7）：2105－2111.

［4］ 袁梦冬,辛玉峰.1株异养硝化－好氧反硝化菌的分离鉴定及脱氮活性［J］.北华大学学报（自然科学版）,2012,13（3）：339－343.

［5］ Hung－Soo Joo,Mitsuyo Hirai,Makoto Shoda.Characteristics of ammonium removal by heterotrophic nitrification－aerobic denitrification by alcaligenes faecalis No.4［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering,2005,100（2）：184－191.

［6］ Joong Kyun Kim,Kyoung Joo Park,Kyoung Sook Cho,et al.Aerobic nitrifica－tion－denitrification by heterotrophic Bacillus strains［J］.Bioresource Technology,2005,96（17）：1897－1906.

［7］ Taylor Shauna M,He Yiliang,Zhao Bin,et al.Heterotrophic ammonium removal characteristics of an aerobic heterotrophic［J］.Journal of Environmental Sciences,2009,21（10）：1336－1341.

［8］ Chen Qian,Ni Jinren.Ammonium removal by Agrobacterium sp.LAD9capable of heterotrophic nitrificationaerobic denitrification［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering,2012,113（5）：619－623.