异福片中利福平有关杂质研究

张涛 孙婷 黄灵勇 徐艳 王东凯

（1沈阳药科大学 辽宁 本溪 117004）

（2沈阳沃森药物研究所 辽宁 沈阳 110016）

异福片是利福平和异烟肼组成的固定剂量复方制剂（Fixed Dose Combination,FDC），由赛诺菲-安万特公司于上世纪研发。该品种现收载于国际药典、英国药典、中国药典等，已列入预认证（Prequalification Program, PQ）品种目录。本课题是中国卫生部-盖茨基金会结核病防治项目中“中国抗结核FDC药品的质量保证”子项目的一部分。本课题参照ICH指导原则开展了分析方法验证和降解杂质研究，为制药企业开展高端仿制药杂质研究提供参考依据。

1.仪器与材料

1.1 仪器和设备

Agilent1200型高效液相色谱仪（配有在线脱气机、四元泵、自动进样器、UV检测器和Chemstation工作站，美国Agilent公司），高纯水机，微孔滤膜及过滤装置。

1.2 试剂和试药

利福平对照品（批号：L0J351，USP），异烟肼对照品（批号：10G205，USP），卫非宁Rifinah（规格：福平300mg/异烟肼150mg；批号：A1462；诺菲-安万特公司意大利工厂生产），利福平原料药（漯河南街村药业集团制药有限公司生产），异福片（规格：利福平300mg/异烟肼150mg；批号：130501YF、130502YF和130601YF；华北制药股份有限公司生产，高密度聚乙烯瓶、铝塑铝封口签），醌式利福平对照品（批号：130413-201104，纯度94.6%，中国食品药品检定研究院），甲醇为色谱纯，磷酸二氢钾和乙酸为分析纯，水为超纯水。

2.方法与结果

2.1 溶液的制备

稀释液：取甲醇和pH7.0磷酸盐缓冲液适量，按体积比4∶6混合后备用。

供试品溶液：取待测样品20片，研细。取该粉末适量，使含利福平约40mg，精密称定，加入200mL稀释液中充分振摇，滤过，即得。

对照溶液：精密量取供试品溶液5mL，置100mL量瓶中，加稀释液定容，充分振摇，即得。

对照品溶液：精密称取利福平对照品适量，置于50mL量瓶中，加入稀释液溶解并制成每1mL中约含0.2mg利福平的溶液，作为利福平对照品溶液。精密称取异烟肼对照品适量，置于50mL量瓶中，加入稀释液溶解并制成每1mL中约含0.1 mg异烟肼溶液，作为异烟肼对照品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱（25cm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-pH7.0磷酸盐缓冲液（6∶4）；流速1.0mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μl。

测定过程：溶液临用现配，避光操作。HPLC系统适用性试验通过后，取上述对照溶液和供试品溶液，依次注入液相色谱仪，记录色谱图。按主成分自身对照法以保留时间对各杂质定位、以峰面积计算各杂质的量，即得。色谱图上，面积小于0.02倍主成分峰的色谱峰（0.1%）和相对保留时间小于0.23的色谱峰忽略不计。[2]

2.3 方法学验证

2.3.1 系统适用性试验 取杂质对照品溶液，照2.2项下色谱条件测定。结果，利福平峰和醌式利福平峰的分离度大于4，系统适用性良好。

2.3.2 专属性 依次注入异烟肼、利福平、醌和腙的对照品溶液，结果异烟肼出峰时间在2.5 min左右，RRT小于0.23，不干扰杂质测定；醌、腙和利福平分离良好，互不干扰。按照异福片处方制备不含利福平的空白溶液，在2.2色谱条件下测定。结果在利福平和各杂质出现的位置无色谱峰出现，表明溶剂和辅料对杂质测定结果无干扰。

2.3.3 检测限 精密称取利福平对照品适量，定量稀释成系列低浓度溶液，峰值信号与基线噪音比较，信噪比为3∶1时的浓度为 0.1261μg·mL-1。

2.3.4 定量限 精密称取利福平对照品适量，定量稀释成系列低浓度溶液，峰值信号与基线噪音比较，信噪比为10∶1时的浓度为 0.3301μg·mL-1。

2.4 样品测定

2.4.1 异福片中杂质实际水平 取3批异福片，照2.2色谱条件测定有关物质。结果，异福片中平均水平大于0.1%（报告阈值）的杂质有6个，同时也大于0.2%（鉴别阈值和界定阈值）[3]，见表。

表 异福片中实际杂质情况Tab.Actual impurity of Rifampicin and Isoniazid Tablets

在一定条件下，制剂中的利福平可发生水解（主要形成3-甲酰利福霉素及25-去乙酰基利福平）和氧化（主要形成醌式利福平和N-氧化利福平），还可与异烟肼发生化学反应形成腙[2]。另外，利福平原料药中还可能存在利福霉素SV。

测定利福平对照品（USP）和参比制剂（Rifinah）的有关物质可知，利福平对照品中含有1、2、4、5号杂质，参比制剂中含有1、4号杂质。这些杂质超过了鉴定阈值，可认为经过了安全评估。供试品中这些杂质的平均水平没有超过法定对照品或参比制剂的水平，是安全的。

2.4.2 强光照射 根据利福平原料药遇光变质的特性，设计试验考察强光对杂质的影响以及包装对产品的保护作用。取同一批号的异福片60片，随机分成三份，每份20片。其中一份为裸片、一份为裸片外包裹铝箔、一份为市售包装，并列平铺摆放，置光照箱内接受冷白日光灯和近紫外灯连续照射。分别于第5天和第10天取样，依2.2色谱条件测定有关物质。结果，异福片裸片中醌有明显增加，市售包装及暗对照几乎没有变化。

2.4.3 杂质分析及控制 综合以上结果，因为辅料和异烟肼在2.2色谱条件下没有杂质峰，而利福平有，因此，可以确定这些杂质都是利福平有关杂质，或为利福平降解产生或为利福平带入。醌是利福平经光照或氧化的降解产物，易生成、增速快，生产中应避光操作、保证产品密封性，必要时充氮。腙是利福平与异烟肼反应的产物，易生成、增速快，在有水的情况下反应更快[4]，生产中宜采用减少接触、干法制粒并严格控制颗粒水分等措施来保证。杂质1在高湿下增长明显，可能为利福平水解产物，生产中应严格控制颗粒水分。杂质2在高温下增长明显，应为利福平降解产物。杂质4和5在高温高湿及加速条件下几乎不增长，可能为利福平带入的工艺杂质，需完善利福平采购标准来控制。

3.讨论

3.1 在抗结核FDC的活性成分中，异烟肼为化学合成，性质稳定，纯度高，4个特定杂质均在0.1%以下，可以忽略。而利福平为发酵产物，纯度较低，杂质多，易降解和水解。因此，本研究重点考察了利福平的相关杂质。

3.2 本文研究了利福平相关杂质，确定了各杂质的来源、检测方法和限度要求，便于生产和质量控制。其中醌和腙是最易增长的两种杂质，需要单独控制。

3.3 本研究证明了国产异福片通过优化工艺、加强过程控制和提高质量标准，可以使其杂质控制水平获得提升，符合国际药典标准。

3.4 本研究中1,2,4,5号杂质虽然超过了ICH推荐的鉴定阈值和界定阈值，但经过了评估，可依据“其它单个杂质”项进行控制。在这里，笔者认为药典中有关物质项下的“其它单个杂质”即“any other peak”，应当是制药企业或上市许可持有人研究过并被批准列入内控质量标准中的杂质，而非任意的其它未知杂质。其它未知杂质仍要按照ICH Q3的原则进行控制。

3.5 本研究中一些杂质没有最终确定化合物结构，下一步将继续对它们进行深入研究。

【参考文献】

[1]The International Pharmacopoeia(国际药典).2017.Seventh Editon.http：//apps.who.int/phint/en/p/docf/

[2]ICH Q3B(国际人用药品注册与医药技术协调会议 Q3B新药制剂中的杂质).2006.第二版：70-80.

[3]李冰，姚兰，孙晓军.抗结核固定剂量复方制剂有关物质的测定[J].中国医药工业杂志，2012，43（3）：208-211.