玉米芯强化生物反应器对罗非鱼循环养殖废水脱氮效果研究

邵 留，兰燕月，姬 芬，张 昊，严 铭，张饮江，2

（1.上海海洋大学海洋生态与环境学院，上海 201306；2.水域环境生态上海高校工程研究中心，上海 201306；3.水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306）

循环养殖系统（Recirculating aquaculture systems，RAS）与传统养殖模式相比，具有集约化、高产率、节水、节地等优点，是水产养殖行业发展必然趋势。但是其集约化养殖模式导致投饵增加，残饵增多，加之鱼体生理代谢产生大量氮磷等营养物质，加速水质恶化。大多循环养殖系统中，主要采用生物过滤器的硝化作用将毒性较强的氨氮和亚硝酸盐转化为毒性较弱的硝酸盐，来保证鱼类的安全与有效生长，却忽略了硝酸盐大量积累对养殖对象的影响。DAVID等［1］研究表明硝酸盐浓度的累积明显抑制虾类存活率，引发胰腺病变，降低产量；另外，高浓度的硝酸盐条件下，水生动物组织发育减缓、激素分泌功能下降［2］，生理机能变弱甚至死亡［3－6］。相关研究［7］表明循环养殖系统中硝酸盐安全浓度为50 mg·L－1以下，但目前循环养殖系统应用反硝化作用来降低硝酸盐浓度技术尚不成熟［8］，一般多采用换水来保证系统中硝酸盐浓度不超标，并不能从根本上解决硝酸盐积累问题。

本研究设计了一种可有效降低养殖废水中氮浓度的新型脱氮技术工艺，主要针对养殖水体C／N比偏低，溶氧偏高等特点，采用研究较少的农业废弃物 玉米芯作为反硝化碳源和生物膜载体，通过人工强化挂膜方式建立同步硝化反硝化脱氮系统（Simultaneous nitrification and denitrification，SND），该系统对节约水资源，减少养殖活动对环境污染，以及发展可持续的生态渔业都具有重要意义与学术价值。本研究试图在实验室条件下通过检测进出水的水质变化，探索新型工艺的脱氮效果，并对新型装置的脱氮机理进行初步分析，以期为集约化工厂循环养殖系统水质改善提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 玉米芯脱氮强化反应器

新型反应器设计如图1所示，柱状反应器材质为有机玻璃，参数为20 cm（D）×47 cm（H，有效水深），养殖废水由储水池经蠕动泵进入反应器，控制流速为（20±0.31）mL·min－1，装置运行前将已人工强化挂膜的玉米芯（干重为1 kg）投入柱状反应器内。

图1 装置示意图Fig.1 Scheme of a laboratory－scale experiment注：1.储水池；2.蠕动泵；3.进水口；4.出水口；5.玉米芯Note：1.Feed vessel；2.Peristaltic pump；3.Inlet；4.Outlet；5.Corncob

1.2 玉米芯表面挂膜流程

硝化菌富集培养：选取鱼塘底泥作为接种物，加入自行配制的培养液后于25℃恒温培养20 d，控制pH在7.2～7.5之间，充气使DO保持在4 mg·L－1以上；硝化菌培养液采用改良的Stephenson培养液。

反硝化菌富集培养：实验所用菌种污泥来源于上海市滨海污水处理厂，取回后的活性污泥用反硝化菌富集培养液（KNO32.0 g·L－1；K2HPO40.5 g· L－1；MgSO4· 7H2O 0.2 g· L－1；C4H4KNaO6·4H2O 20 g·L－1）富集培养7 d。培养期间充氮气排除水体溶解氧，维持厌氧环境。

微生物富集培养成功后，先将玉米芯投入反硝化菌液中充分浸泡1 d，再将富集培养好的硝化菌用喷壶均匀喷洒在已浸泡过反硝化菌的玉米芯外层。

1.3 实验用水

根据前期监测罗非鱼（Oreochromis spp.）RAS系统水质指标，取上海海洋大学校内湖水经0.45 μm膜过滤后，添加适量 KNO3、NH4Cl、KH2PO4配置实验污水，具体进水水质指标如表1所示。

1.4 实验分析方法及数据处理

装置进出水水样每2 d取一次，采用国标法［9］测定相关指标。其中，TN：过硫酸钾氧化-紫外分光光度法，NO－2-N：N-（1－萘基）-乙二胺光度法，NO－3-N：紫外分光光度法，NH＋4-N：纳氏试剂光度法；TOC：采用总有机碳分析仪测（TOC-V.CPH，岛津）测定；水温、DO、pH采用多参数水质测量仪（YSI556MPS，美国维赛公司）测定。

实验共选取6个不同时间点，采集菌液及玉米芯表面生物膜样品，具体采样时间见表2。采集后的样品经DNA提取及PCR扩增后送至上海美吉生物医药科技有限公司，采用高通量分子测序技术对微生物群落结构分析（表3）。技术方法为：提取样品总DNA→PCR扩增和产物纯化→PCR产物定量和均一化→Miseq PE文库制备→Miseq高通量测序→生物信息分析实验所得数据均记录为“算术平均值±标准差”（Mean±SD），利用SPSS17.0软件进行数据分析。

表2 样品序号及采集时间表Tab.2 Sample number and sampling time

表1 实验用水基本水质指标Tab.1 Indicators of water quality

表3 PCR扩增引物及序列Tab.3 PCR amplification primer and sequence

2 结果与分析

2.1 装置对氮的去除效果

实验期间装置出水NH＋4-N、NO-3-N、TN浓度及去除率变化如图2（A，B，C）所示，经人工强化挂膜后，新型脱氮装置启动迅速，运行第1 d装置氨氮、硝酸盐和总氮的去除率分别达到了56.50%、97.63%和86.08%。

实验前期（1～35 d），系统保持稳定运行状态，该阶段水温一直稳定在20℃以上，TN、NO-3-N、NH＋4-N去除率均保持较高水平。由图2-A可以看出，实验前期装置NH＋4-N最高去除率为64.64%，最低为46.38%，出水NH＋4-N浓度平均为3.50 mg·L－1，装置具备一定的硝化效果。出水NO-3-N浓度及去除率变化如图2-B所示，NO-3-N去除率最高达98.80%，最低为95.25%，出水浓度保持在0.89 mg·L－1左右，这说明即使在高DO（平均DO＞4 mg·L－1）条件下，装置依旧获得了良好的反硝化效果；装置出水TN浓度及去除率变化如图2－C所示，出水TN平均浓度为7.88 mg·L－1，TN最高去除率为 86.61%，最低时为76.61%；综上所述，实验前期新型装置启动迅速，且具有良好的同时硝化反硝化脱氮能力。

实验中期（37～43 d），水温降至15℃左右，出水水质波动较为剧烈，装置 TN、NO-3-N及NH＋4-N去除率均出现明显下降。第43天，TN、NO-3-N及NH＋4-N去除率均降至最低，分别仅为43.12%、49.68%和13.35%。第44天，水温回升后NH＋4-N、NO-3-N、TN去除率均出现不同程度上升，其中NO-3-N和TN去除率最高分别回升至78.79%和63.94%。但去除率依然低于实验前期，这可能是由于生物膜上微生物受温度突降影响较大，微生物群落结构发生了显著变化。后续的微生物分析结果验证了这一猜想（图4）。

实验后期（≥65 d），NO-3-N、TN去除率出现逐步下降趋势，系统NH＋4-N去除率维持在（20～30）%之间。结合图3可以看出，运行时间超过65 d后，出水TOC浓度下降明显，含量普遍低于20 mg·L－1，这说明碳源玉米芯中易被分解的有机物已消耗殆尽，导致反硝化碳源不足，从而使得装置对总氮的去除率出现下降。

图2 NH＋4-N（A）、NO-3-N（B）、TN（C）浓度和去除率变化Fig.2 Changes of NH＋4-N（A），NO-3-N（B），TN（C）concentration and removal rate during experiment period

图3 水温及出水TOC浓度Fig.3 Changes of water temperature and TOC

2.2 生物膜微生物群落动态分析

不同时期玉米芯表面生物膜微生物群落结构图如图4所示，生物膜上脱氮优势种如表4所示。生物膜上硝化细菌主要由亚硝酸螺菌属（Nitrosospira）、亚硝酸单胞菌属（Nitrosomonas）、亚硝酸球菌属（Nitrosococcus）3个属组成。反硝化菌主要由产碱菌属（Alcaligenes）、副球菌属（Paracoccus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans）组成。

图4 微生物门水平（A）及属水平（B）群落结构及相对丰度Fig.4 Bacterial community and abundance（A：at phylum level；B：at genus level）

表4 脱氮菌优势种类分析Tab.4 Dominant species of nitrobacteria and denitrobacteria

由表4可以看出，代表富集培养的反硝化菌液的3号样品检测出4个种类的硝化细菌和7个种类的反硝化菌；代表富集培养的硝化菌液的4号样品检测出4个种类的硝化细菌和7个种类的反硝化菌；代表挂膜成功的1号样品共检出4个种类的硝化细菌和8个种类的反硝化菌；代表装置运行前期状态的5号样品检测出1个种类的硝化细菌和8个种类的反硝化菌，；代表装置运行中期状态的6号样品检测出2个种类的硝化细菌和8个种类的反硝化菌；代表装置运行后期状态的2号样品检测出2个种类的硝化细菌和6个种类的反硝化菌。综上所述，从脱氮微生物菌群的种类组成来看，排列顺序为：1＞3、4＞5、6＞2，可见随着运行时间的延长，生物膜上脱氮微生物种类呈下降趋势。此外，每个样品中反硝化菌种类明显比硝化细菌种类多，这个结果和硝酸盐去除率高于氨氮去除率高度对应。

从脱氮微生物优势种来分析，代表富集培养的反硝化菌液的3号样品脱氮微生物优势种为假单胞菌属（Pseudomonas）反硝化菌和脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans）。代表富集培养的硝化菌液的4号样品脱氮微生物优势种为亚硝酸螺菌属（Nitrosospira）和亚硝酸单胞菌属（Nitrosomonas）硝化菌。代表挂膜成功的1号样品脱氮微生物优势种为假单胞菌属（Pseudomonas）反硝化菌。代表装置运行前期状态的5号样品脱氮微生物优势种为假单胞菌属（Pseudomonas）反硝化菌、脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans）以及脱氮副球菌属（Paracoccus）。代表装置运行中期状态的6号样品脱氮微生物优势种为假单胞菌属（Pseudomonas）反硝化菌和脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans），以及亚硝酸单胞菌属（Nitrosomonas）硝化菌。代表装置运行后期状态的2号样品脱氮微生物优势种为脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans）。经过对脱氮微生物生物量的统计分析得出，6个样品脱氮微生物生物量由大到小顺序为：5＞4＞1＞3＞6＞2，可见运行初期状态的5号样品脱氮微生物最多，而挂膜成功的1号样品和硝化菌富集培养液的4号样品次之，脱氮微生物数量最少的是试验结束后采集的2号样。这与出水TN浓度变化相一致。

3 讨论

3.1 新型工艺优缺点分析

本实验采用玉米芯同时作为反硝化碳源和生物膜载体，借助独特的人工强化挂膜技术实现了高DO状态下的同步硝化反硝化脱氮。国内外学者对同步硝化反硝化技术进行过不少研究［10－19］，如曹国民等［10－11］以聚乙烯醇为载体，采用冷冻－解冻法混合并固定富集培养的硝化菌和反硝化菌，实现了SND。本研究采用人工富集培养结合新型强化挂膜方式，实现了SND，并取得了明显的脱氮净化效果。HYUNGSEOL等［12］采用间歇曝气－排出工艺初步实现了亚硝酸型同步硝化反硝化作用，并且通过实验构建了该工艺SND废水脱氮控制参数。LIANG等［13］采用垂直生物膜反应器研究同步硝化反硝化脱氮效果时，发现总氮去除率最高达57.94%。本实验结果表明，在进水高DO情况下，装置仍能取得较好的脱氮作用，TN去除率最高达86.61%，脱氮效果优于已有报道。

本实验采用易获取、易降解、微生物易附着的农业废弃物玉米芯作为反硝化碳源，目前针对该外加碳源的研究较少。王芳等［15］在立体生态浮床中层填料中添加玉米芯，运行2个月后NH＋4-N、TN和CODMn的去除率分别达到96.77%、95.51%和77.75%，其中玉米芯对总氮去除贡献率为40%。XU等［16］通过研究玉米芯固体碳源的脱氮效果，发现硝酸盐去除率达80%以上，且表现出较强的持久供碳能力。玉米芯凹凸结构，表面积大，便于微生物附着生长，启动时间相对缩短，这与其它报道相比节省了时间［17，20］。另有研究表明［21－22］，以水体中 NO-3-N去除量计算反硝化费用，甲醇、乙醇、乙酸、PHB、PCL、棉花费用分别为 2.0～4.0μkg－1、2.4 μkg－1、8.0μkg－1、21.0～37.2μkg－1、6.6～8.9 μkg－1、2.12μkg－1，而玉米芯仅为 0.113μkg－1。相比而言，本研究工艺极大地简化了传统生物脱氮工艺流程，并提高了脱氮效率，节省了投资和时间，明显提高了处理效果，为今后养殖水体净化工艺和农业废弃物的再利用提供了理论基础。但本工艺也存在缺陷，如出水有机物含量偏高，存在二次污染隐患，因此后续研究中将根据单位体积养殖废水净化所需碳源量精确计算玉米芯的投放量。

3.2 温度及碳源对脱氮效果的影响

本研究发现温度对新型工艺脱氮性能影响较大，当温度低于20℃时，装置脱氮作用明显降低，TN去除率从85%降至50%以下。温度回升后装置脱氮性能又呈上升趋势，TN去除率重回63%以上。李贤胜［23］研究温度对同步硝化反硝化过程中，发现当温度在6～30℃之间时，氨氮去除率与温度成正比，而当温度低于6℃或者高于30℃时，去除率下降。也有研究［24］发现10～20℃硝化菌较为活跃，20～25℃时反硝化菌较为活跃，这与本实验温度低于20℃时，TN去除率下降，尤其是硝化作用减弱的现象一致。

另外，本研究还发现碳源对装置脱氮效率有较大影响。在实验后期，碳源出现供应不足时，装置TN去除率明显下降。碳源作为异养反硝化菌必需的物质和能量来源，其含量直接影响反硝化作用的进行。装置运行初期，碳源供应较为充足，装置脱氮能力较高，后期当出水TOC浓度降低至20 mg·L－1以下时，总氮、硝酸盐去除率呈快速下降趋势，这与出水TOC浓度变化趋势高度拟合。胡宇华等［25］通过研究同步硝化反硝化体系中有机碳对氨氮去除率的影响，得出在进水初始氨氮浓度为35 mg·L－1时，当水体有机碳浓度在400～1 000 mg·L－1时，氨氮降解率最高可达到99.5%。周丹丹等［26］研究有机碳对同步硝化反硝化作用影响时，发现总氮去除率随C∶N比增加而增加，碳氮比为10.05时，总氮去除率达到最高70.39%。赵冰怡等［27］通过实验证明，当增加碳源使C∶N比为6∶1～8∶1时，总氮去除率最高，为79% ～89%，碳源减少时，总氮去除率也随之降低。魏海娟等［28］通过研究外加碳源对TN削减的影响发现，葡萄糖作为安全和经济情况下的最佳碳源，TN去除率最高时为80.55%。因此，今后要在延长或改进碳源的后续添加工艺对废水脱氮的影响方面开展进一步研究。

3.3 新型工艺同步硝化反硝化脱氮机理分析

从物理学角度来看，本研究装置中实现同步硝化反硝化作用的主要原因为：反应器内氧气混合不均匀，且DO在生物膜内传递时通过渗透扩散，因此形成玉米芯生物膜外部DO较高，内部DO较低现象。本研究采用农业废弃物玉米芯作为新型碳源，人为在玉米芯表面挂膜形成以反硝化菌为主的厌氧生物膜内膜及以硝化菌为主的好氧生物膜外膜，从而促进SND的实现，本研究结果也很好地反映了该工艺装置具有很好的脱氮效果。此外，外层硝化菌在硝化过程中消耗了大量溶氧，进一步促进了生物膜内部缺氧微环境的产生。本工艺在进水高DO情况下仍能维持良好的脱氮效果，另一个因素也同样不可忽视，即由于载体碳源玉米芯的分解，进一步降低了生物膜内层的DO水平，从而使得生物膜内层始终处于缺氧或厌氧状态。经微生物分解后的玉米芯源源不断的为内层反硝化菌提供了反应所需的电子供体，促进了反硝化的顺利进行。有机碳源越充分，水体C∶N越高，反硝化获得的碳源越充足，SND越明显，这一观点得到了较多研究者的认可［26，29－30］。

从生物膜上微生物群落结构分析结果来看，发现随着运行时间延长，生物膜上脱氮微生物的种类和数量均出现下降。即从脱氮微生物菌群的种类组成来看，排列顺序为：代表挂膜成功的1号样品脱氮微生物种类最多，其次是代表实验前期和中期的5号和6号样品，种类最少的是经过长期运行后采集的2号样品。这一结果表明人工干预的快速挂膜方式是可行并成功的，且随着装置运行时间的延长，生物膜上脱氮微生物种类会有所降低。这可能是水流原因部分生物膜脱落，且实验中期温度起伏变化较大对菌种数量和种类具有一定影响。从脱氮微生物数量上来看，代表实验运行前期的5号样品生物量最多，其次是代表挂膜成功时的1号样品，脱氮微生物数量最少的是代表实验后期的2号样品。这一结论与新型脱氮装置长期运行后脱氮效果有所降低相一致，从生物膜上微生物层面阐述了新型脱氮装置的脱氮机理。

4 小结

（1）以农业废弃物－玉米芯为碳源和载体的养殖废水脱氮强化工艺，通过人工强化挂膜的方式实现了内层以反硝化菌为主，外层以硝化菌为主的微生物群落结构，使玉米芯表面有效形成外层好氧－内层厌氧环境，从而实现SND过程，有效去除养殖水体的硝酸盐和氨氮，两者的去除率最高分别达98.80%和64.64%，新工艺减小了占地面积，降低了能源消耗和基建投资。

（2）温度变化对装置脱氮效率影响较大。实验运行期间，由于外界温度骤降，导致装置脱氮效果下降明显。因此，建议在实际应用中需在温度变化较大区域安装控温装置。

（3）微生物群落结构分析表明，玉米芯介导的新型装置生物膜上微生物以反硝化菌为主，硝化菌为辅，且每个样品中反硝化菌种类明显比硝化细菌种类多；不同运行时间，生物膜上脱氮微生物生物量由大到小顺序为：前期〉中期〉后期，即随着运行时间的延长脱氮微生物量呈下降趋势。

（4）本实验中，装置运行前期的出水有机物含量偏高，易造成二次污染，因此在后续研究中，我们将根据单位体积污水净化所需碳源量来深入计算玉米芯的投放量。

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