山西省旱柳古树资源遗传多样性的SSR分析

张 亮，王振龙，高志文，马 晶，樊明瑞，韩志校

(1.山西省太原市林业科学研究所，山西 太原 030009；2.河北农业大学，河北 保定 071000 )

旱柳(SalixmatsudanaKoidz.)，属于杨柳科柳属落叶大乔木，其分布广泛，在全国各地都有栽培，主要品种与变种有馒头柳、绦柳、龙须柳等。它是防护林、水土保持林、园林绿化林及用材林的重要组成树种，具有较高的生态价值和经济价值。古树是有生命的活化石，是大自然给人类的宝贵财富，具有重要的科研、历史、文化价值，保护好它们有着十分重要的意义。

SSR已成为在生物上应用最广、最为重要的分子标记。目前，SSR标记已经在众多植物种类中得到证实和应用,例如,葡萄、松树等物种。而柳树分子标记的研究始于20世纪90年代，如，王辉等利用SSR标记的方法对杨柳树遗传多样性进行了分析，刘恩英建立和优化了柳树SSR反应体系，王源秀利用杞柳和簸箕柳候选杂交亲本对其SSR指纹进行了分析等。而对山西省不同地区旱柳古树资源遗传多样性的SSR研究还未见报道。笔者尝试用SSR分子标记的方法对采自山西省7个地区的49份旱柳古树材料进行遗传多样性检测，旨在从DNA分子水平阐明其地区间的遗传差异，为旱柳古树资源的有效保护，柳树新品种的选育及遗传改良抗性研究提供理论支持，并从分子水平上丰富对古树的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

2009年至2011年，太原市林业科学研究所柳树课题组收集了山西省境内的古旱柳品种(见图1)。通过嫁接复壮、扦插等繁殖手段，至2012年已培育出49个合格的古旱柳品种2年生苗木各200株。于当年秋季苗木生长停止后，在树冠1/3处，采集枝条、叶片等材料，封装进冷藏保温箱并做好标记，在4 h内送至河北农业大学进行试验。

图1 供试材料所在地理位置及取样情况

1.2 方法

基因组DNA提取采用改良的CTAB法。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，经紫外分光光度计测定纯度后，再用ddH2O稀释至20 ng/μL左右。

试剂：所用引物均来自文献[12-13]，并由上海生工生物工程技术服务有限公司和北京天一辉远生物科技有限公司合成。2×Taq MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司。

PCR反应体系：柳树DNA基因组SSR-PCR 10 μL 反应中最优条件为2×Taq MasterMix 5μL，引物浓度为1.0 μmol/L,H2O为3μL,DNA为1μL.

PCR扩增反应：PCR扩增94 ℃预变性5 min后，95 ℃变性50 s，52 ℃复性50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环。最后一个循环结束后，再72 ℃延伸7 min，得扩增产物。

反应产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳40 min左右，取出进行AgNO3染色。再用显色液(1.5%NaOH，0.4%甲醛)显色，直至条带清晰为止，照相并记录。

1.3 数据统计分析

选择扩增条带清晰且有多态性的SSR标记进行数据统计，假定胶上迁移率相同的条带均来自同一位点上的同一等位基因。对每个样品的扩增电泳谱带进行统计，有带记为1，无带或模糊的记为0，形成0/1数据矩阵输入Excel中。SSR数据用POPGENE32和DPS软件进行遗传多样性数据计算。

2 结果与分析

2.1 古旱柳引物筛选与多态性分析

从25对引物中选取10对扩增条带清晰、重复性好、特异性高的引物。这10对引物在7个地区的49个旱柳古树品种中共扩增出条带33条，其中多态性条带26条，占78.79%(如表1).每对引物扩增位点数为2～5，平均每对引物扩增3.3个位点。

表1 引物多态性分析

从扩增结果来看，SSR引物得到的扩增产物片断大小主要分布在80 bp～320 bp之间。其中引物SB24，SB233，GslMCT011，ORNL140多态性最高，达到100%；ORPM-028多态性最低，为50%；其余引物介于两者之间。

图2为引物SB24和引物ORPM-028扩增出的部分样品图谱。

图2 SB24引物和ORPM-028引物对供试的部分旱柳古树的SSR扩增谱带

从图2可以看出，不同引物在相同材料中产生的谱带信息不同，同一引物在不同的材料中产生的谱带信息也不相同。这说明供试的旱柳古树在DNA+水平上具有一定的差异。

2.2 古旱柳种群内遗传多样性参数

地区间旱柳古树的多态位点百分率、Nei′s基因多样性和有效等位基因范围分别为39.39%～69.70%，0.121 6～0.208 6和1.189 3～1.341 2,见表2.

表2 7个地区间旱柳古树资源的遗传多样性参数值

从表2中可以看出,7个地区间多态性比率差异较大，在39.39%～69.70%之间。其中朔州(地区B)地区的多态性比率最高，达到了69.70%；晋中(地区E)、临汾(地区G)、吕梁(地区F)最低，为39.39%.7个地区的多态性高低为：B>A>C>D>E，G，F.各群体间Nei′s基因多样性和有效等位基因排列与多态位点百分率一致。

2.3 古旱柳群体间遗传一致度及遗传距离

古旱柳群体的遗传一致度(I)与遗传距离(D)见表3.

表3 旱柳古树群体的遗传一致度与遗传距离

由POPGENE32软件计算的7个地区间旱柳古树的遗传距离和遗传一致度表明，古旱柳群体间的遗传一致度很高(0.865 1～0.990 7)，尤其是地区C与地区D之间遗传相似度最大(0.990 7)，接近于1，表明两个地区几乎没有分化。地区E与地区G之间的遗传一致度最低(0.865 1)。遗传距离在地区E和地区G之间最大(D=0.144 9)，地区C和地区D之间最小(D=0.009 4)。

不同地区旱柳古树的遗传聚类图见图3.

图3 不同地区旱柳古树的遗传聚类图

由图3可以看出，7个地区的旱柳古树资源通过聚类分成了两大类，第Ⅰ类为：大同(地区A)、朔州(地区B)、忻州(地区C)、太原(地区D)、晋中(地区E)、吕梁(地区F)；第Ⅱ类为：临汾(地区G)。这也说明了处在山西省中北部6个地区的旱柳古树聚在了一起，而处在南部临汾地区的单独聚在了一起。

2.4 不同地区古旱柳材料的聚类分析

利用DPS软件中的UPGMA法对分布在山西省7个地区的49份旱柳古树材料进行聚类分析，结果见图4.

图4 不同地区旱柳古树植株的遗传聚类分析

由图4可以看出，在遗传距离为0.53处，所有植株可以分为两类：一类是包括所有地区的40个古旱柳品种；一类是包括大同、朔州、忻州3个地区的9个古旱柳品种。说明这9个品种与上述40个古旱柳品种有一定的差异性，同时，49个古旱柳品种个体的聚类结果与7个地区间的聚类有差别。

3 讨论与结论

研究表明，一个物种遗传多样性越高，对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新环境。笔者用10对引物对采自山西省7个地区的49个旱柳古树植株进行了地区间遗传多样性分析，结果表明，其具有丰富的遗传多样性。选用的10对引物共扩增出条带33条，其中多态性条带有26条，占78.79%.由此可见，这7个地区的旱柳古树材料具有比较丰富的SSR多态性。

Nei′s遗传多样性揭示了各地区间遗传多样性水平，利用SSR分子标记方法测得的7个地区旱柳古树的Nei′s遗传多样性范围为0.121 6～0.208 6，均值为0.165 3，其排列顺序依次是：朔州>大同>忻州>太原>晋中、临汾、吕梁,它与地区间的多态性比率一致。说明这7个地区间旱柳古树具有较丰富的遗传多样性。

通过对这7个地区的旱柳古树进行聚类分析可知，地区间的遗传一致度很高，尤其是地区C与地区D之间遗传相似度最大，接近于1，表明两地区几乎没有分化；地区E与地区G之间的遗传一致度最低。7个地区间聚类结果得到两类，并且具有地理相关性，一类是种植在山西省中北部6个地区的旱柳古树，一类是种植在山西省南部临汾地区的旱柳古树。

对来自这7个地区的49个品种个体之间的聚类结果表明，虽然柳树主要是通过无性繁殖，但是来自山西省7个不同地区的49个旱柳古树品种间却存在遗传差异，并非起源于同一无性系。另外，49个旱柳古树材料聚类结果呈现混杂性，并不是同一种植地区的植株聚在一起。说明这些古旱柳个体是在几十年至几百年前栽种的，由于时间不同，应用的品种可能不同。虽然是在同一地区甚至同一地点收集的旱柳古树，其遗传差异也可能会很大。从而也进一步说明了这些旱柳古树具有广泛的遗传多样性。

山西省旱柳古树存在广泛的遗传多样性，是宝贵的遗传资源，应加大保护和研究力度，为柳树的遗传改良提供育种材料。

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