牛板筋中单核细胞增生李斯特氏菌的检测研究

贾冰凝

摘 要：单核细胞增生李斯特氏菌是一种重要的食源性致病菌，对食品安全和人类健康具有危险性。本文通过对牛板筋中单增李斯特菌检测的微生物法、全自动微生物鉴定仪法和荧光PCR法这3种方法进行研究，得出结论：3种方法结果具有较高一致性，其中荧光PCR法快速、高效，在食品安全抽检和监测工作中值得应用和推广。

关键词：单增李斯特菌 牛板筋 检测方法 检出率

中图分类号：TS202 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2018）11（a）-0-03

单增李斯特菌是一种常见的食源性致病菌，可导致新生儿、孕妇、老年人及免疫力低下等敏感人群发生脑膜炎、流产、败血症、死胎、胃肠炎等，严重损害健康，死亡率达到30%左右。食物是李斯特菌传播的主要途径[1]，且該菌在污染的食物中，可于低温保藏时缓慢生长，达到引起感染所需的剂量[2]。

牛板筋是指牛背部两块连接全身运动肌肉的主大筋，因为它好吃，有嚼劲，所以受到很多人的喜爱，近年来大量出现在烧烤餐饮市场。以前各家烧烤店通常自己购进牛板筋原料，进行手工穿串，现场烤制。随着夜市生活的繁荣，牛板筋的需求量逐年增大，加工过程逐渐发展成为产业化。由于有的生产企业在加工、储存、运输等环节质量控制不严格，造成供应烧烤市场的牛板筋受到单增李斯特菌污染，加之烤制过程不能够充分灭菌，导致存在较大的食品安全隐患。因此，加强对此类食品及其原料的市场抽检监测，预防食品安全事故发生，显得尤为重要。

食品中单增李斯特菌的检测方法通常有：微生物法、全自动微生物鉴定仪法和荧光PCR法3种方法，本文通过研究近几年运用荧光PCR法的检测实际，并与其他两种方法的测定结果进行比较分析，找出各种方法的特点，为开展食品及其原料的市场抽检监测提出建议。

1 材料和方法（实验部分）

1.1 实验材料

近几年委托、监督、国抽送检的牛板筋肉制品。

1.2 试剂与仪器

（1）标准菌：单增李斯特菌ATCC19115；英诺克李斯特菌ATCC33090；伊氏李斯特菌ATCC19119；斯氏李斯特菌ATCC35967；金黄色葡萄球菌ATCC25923；马红球菌ATCC6939；阪崎肠杆菌ATCC25944；肠炎沙门氏菌ATCC14082；大肠埃希氏菌ATCC25922；志贺氏菌ATCC51572；铜绿假单胞菌ATCC27853均由本中心微生物实验室保存。

（2）培养基和试剂；LB、PALCAM、李斯特显色培养基、TSA-YE、血平板、多种微量生化鉴定管军购自青岛海博，科马嘉李斯特显色培养基购自上海申工，GP（革兰式阳性）鉴定卡（法国生物梅里埃公司）、DNA提取试剂盒、PCR试剂均购自大连宝生物工程有限公司

（3）仪器设备：超低温冰箱（松下冷链大连有限公司）低温培养箱（德国BINDER）、VITEK2全自动微生物生化鉴定仪（法国生物梅里埃公司）、小型恒温槽（日本HAITEC公司）、高速冷冻离心机（日本HAITEC公司）、核酸蛋白分析仪（美国热电）、实时荧光定量PCR检测系统（德国Epperdorf公司和美国伯乐公司）。

1.3 试验方法

（1）传统微生物法。

①增菌分离；抽样和送样按照GB 4789.1-2010、GB 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》二级采样，n=5，c=0，m=0[3]，检测方法按照GB 4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行。25g样品+225mL LB1，均质，30℃，24h前增菌，取1mL LB1至10mL LB2中，30℃，24h后增菌，取LB2增菌液划线PALCAM和李斯特显色培养基36℃，24h+24h进行分离培养，若污染较严重，PALCAM和法国科马嘉李斯特显色培养基24h内即可观察[4]。

②初筛：挑取现色板上典型或可疑菌落接种木糖、鼠李糖，并同时划线TSA-YE平板，36℃，18h-24h培养，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物进行鉴定。

③生化鉴定：染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试验均按照GB4789.30-2016执行并结果判定。

（2）全自动微生物鉴定仪法：制备0.6左右麦氏浓度菌悬液（TSA-YE平板上菌落），GP鉴定卡，上机测试。结果查对VITEK2鉴定细菌目录。

（3）实时荧光PCR法。

①模板DNA的制备（两种）。

第一，利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）。吸取1.5mL LB1增菌液至2mLEP管中，离心，弃上清液，若沉淀量少，再次吸取1.5mL LB1增菌液，离心，弃上清液，以下步骤按照产品说明书进行提取，核酸蛋白分析仪测定DNA含量，260/280=1.8～2.0间，且核酸浓度得量在30～50ng/μL最为合适。浓度若高，需稀释。

第二，水煮裂解法（菌落PCR）。

取TSA-YE上菌落，制成2.0麦氏浓度菌悬液，取1.5mL至2.0mLEP管中，12000r/min离心5min，弃上清，加50μL灭菌ddH2O或TE溶液，旋涡震荡混匀，置小型恒温槽70℃加热10min， -20℃保存备用（以上操作均在P2实验室进行）。

②引物、探针的设计和合成。

根据SN/T 1870-2007《食品中致病菌检测方法 实时PCR法》中公布的单核细胞增生李斯特氏菌检测所用引物和探针序列[5]，委托大连宝生物工程有限公司合成。

③实时荧光PCR反应体系。

反应体系25μL：PCR Mix12.5μL，上游引物（10μmol）1μL，下游引物（10μmol）1μL，探针（10μmol）1μL，模板DNA（10～50ng）2μL，无菌水补至25μL。

反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性 5s、58.2℃延伸40s，进行40个循环。

同时设阳性、阴性及空白对照，空白对照为无菌水。结果及判断执行SN/T 1870-2007。

将1.2小节中（1）所列标准菌提取的基因组DNA，按照上式的反应体系进行试验，结果如图1所示，只有单增李斯特氏菌为阳性，Ct：17.23，18.32，其余10种菌：英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、马红球菌、阪崎肠杆菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌均为阴性，说明该方法特异性较好。

2 结果与讨论

2.1 结果

我中心自2012年开展生肉制品单增李斯特菌检测，近几年加大检测范围，餐饮食品凉拌菜、熟肉制品也增加了此项目检测，检出率逐年增加，尤其牛板筋中检出率最高。见表2。（样品数量为批次，总检测数量为18×5，牛板筋检出阳性数为1×5，以此类推）。2015年牛板筋检测数量占单增李斯特菌总检测样品数量的27.8%，而检出率占总阳性率11.1%中一半，即5.55%为牛板筋，如此，2016年的10.7%的2/3，即7.13%为牛板筋，2017年的12.5%的3/5，即7.5%，即相对阳性率也是增加的。

本实验室为国家级实验室，一般情况下试验方法选择为国家标准方法，即GB 4789.30-2016微生物法。3年来，对3种检測方法得出数据进行了比对分析，一是检测过程中将典型菌落全部进行生化鉴定的同时，进行全自动微生物鉴定仪鉴定和荧光PCR测定。二是选取部分不典型菌落进行生化鉴定、全自动微生物鉴定仪鉴定和荧光PCR测定（见表3），得出结论：3种鉴定方法结果一致，均准确可信；荧光PCR与传统微生物方法相比，其操作简便、准确快速、高通量、高敏感[6]，将会对食品市场抽检监测提供更加准确、快速、高效的技术检测服务。

从表4可以看出，荧光PCR法耗时最少，在时间上占绝对优势。其他方法所需的设备、设施、人力等资源条件都可以通过投入和人员引进培训来满足，达到完成试验任务的目的。而时间是有限的，不可再生，在高速发展的今天，满足服务食品产业发展和食品安全监管的需求，荧光PCR法耗时少的优势是无可替代的。

2.2 讨论

（1）由表2可以看出牛板筋检出单增李斯特菌的阳性率相当高，且呈逐年上升趋势，检出阳性菌均及时上报有关部门。

（2）生化鉴定中GB 4789.30 5.4.5规定协同溶血试验为可选检测项目，依据笔者多年试验经验，溶血试验有时结果不明显。为保证检测数据的准确性和可靠性，及对客户负责的态度（剩余样品和同批次样品不进行微生物项目复检[7]），溶血试验和协同溶血试验应同时进行，并进行结果参照。

（3）因宁夏属西北欠发达地区，食品生产加工企业数量少、规模小，有的质量安全意识不强，质量保证条件较差。3年来检测的牛板筋共20批次，100个样品，从批次上看，检测样品虽不具有普遍性，但仍发现同一生产厂家不同批次的产品受到单增李斯特菌污染，说明有的生产企业在加工、储存、运输等环节质量控制不严格，从而导致微生物污染，带来食品安全隐患。因此，加强对此类食品及其原料的市场抽检监测，预防食品安全事故发生，显得尤为重要。荧光PCR法是比较快速、高效的方法，将会对食品市场抽检监测提供更加有力的技术支撑。

参考文献

[1] World Health Organization. Foodborne listeriosis[R]. Geneva：WHO，1988：421-428.

[2] 陈广全，张惠媛，曾静，等.食品安全检测培训教材 微生物检测[M].北京：中国标准出版社，2010：366.

[3] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布.GB 29921-2013，食品安全国家标准 食品中致病菌限量[S].北京：中国标准出版社，2013.

[4] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局发布.食品安全国家标准GB4789.30-2016，食品微生物检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验[S].北京：中国标准出版社，2016.

[5] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布.SN/T 1870-2007，食品中致病菌检测实时PCR法[S].北京：中国标准出版社，2007.

[6] 刘芳，徐振娜，洪伟彬，等.食品中单增李斯特菌荧光PCR检测方法的建立[J].农村经济与科技，2017（17）：92-93，99.

[7] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局发布.GB 4789.1-2016，食品安全国家标准 食品微生物学检验总则[S].北京：中国标准出版社，2016.