不同PCR 方法检测牛卵形巴贝斯虫的比较分析

田万年， 薛书江， 贾立军， 张守发

(1.吉林农业科技学院动物科技学院， 吉林 吉林 132101；2.延边大学农学院， 吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴贝斯虫病(Babesia ovata)是由巴贝斯科巴贝斯属的卵形巴贝斯虫寄生于牛红细胞内所引起的寄生虫病。 我国于1986 年在河南省卢氏县牛体内发现本病，随后1994 年，在甘肃张家川回族自治县牛体内分离到卵形巴贝斯虫[1]。 目前牛卵形巴贝斯虫的诊断主要通过血液涂片，显微镜检查为主。 PCR 方法是一种快速、敏感、特异的诊断方法，已应用牛卵形巴贝斯虫病的诊断。 Sivakumar等[2]根据AMA-1 基因建立了卵形巴贝斯虫PCR 检测方法。 黄国明等[3]根据卵形巴贝斯虫CCTη 基因设计特异引物，建立了卵形巴贝斯虫巢式PCR 诊断方法。 田万年等[4-5]建立了卵形巴贝斯虫荧光定量PCR 检测方法，对延边地区卵形巴贝斯虫病进行了流行病学调查。 目前国内外未见关于以上3 种方法比较的文献，本试验从敏感性和临床样本检出率方面进行对比，筛选出牛卵形巴贝斯虫病的最佳检测方法。

1 材料与方法

1.1 样本来源 血液样本采自吉林省珲春地区散养的延边黄牛血样86 份，无菌采取抗凝血，用PBS洗3 次。 存于-20 ℃备用。 同时制作了血液涂片，甲醛固定保存，供染色镜检。 牛巴贝斯虫标准基因组DNA 由日本带广畜产大学玄学南教授惠赠，牛瑟氏泰勒虫基因组DNA 由延边大学农学院预防兽医学实验室保存。

1.2 主要试剂 全血DNA 提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2 000 DNA Marker、SYBR Green I Master 等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。 荧光定量PCR 仪为Agilent 公司产品。 PCR 仪为Agilent 公司产品。

1.3 引物的设计与合成 根据GenBank 上登录的牛卵形巴贝斯虫18S rRNA 基因序列(AY081192)，利用Primer Premier 5.0 软件设计了4 对特异引物(见表1)。 引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

表1 试验所用引物信息

1.4 牛卵形巴贝斯虫DNA 标准模板的制备 按照全血基因组DNA 提取试剂盒说明书操作提取基因组DNA，抽提的DNA 用50 μL TE 溶解， -20 ℃保存备用。

1.5 PCR 反应条件 普通PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环，最后72 ℃延伸7 min。 巢式PCR 反应条件：第1 次PCR：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃延伸7 min。 第2 次PCR：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环，最后72 ℃延伸7 min；荧光定量PCR 反应条件：95 ℃5 min；94 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃20 s，共40 个循环。 PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 重组质粒标准样品的制备 经姬姆萨染色后显微镜镜检、PCR 检测测序后确诊为牛卵形巴贝斯虫感染抗凝血，按照全血基因组DNA 提取试剂盒说明书操作提取基因组DNA，应用特异性引物(巢式PCR 外引物)进行普通PCR 扩增，将PCR 产物回收，与pMD-18T 载体连接后鉴定为阳性菌株送至上海英骏生物技术有限公司测序。

1.7 不同PCR 特异性试验 以牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫基因组DNA 为对照样本。分别应用普通PCR、巢式PCR 和荧光定量PCR 进行检测，分析其特异性。

1.8 不同PCR 敏感性试验 将重组阳性质粒在1 ×107Copies/μL 基础上进行10 倍倍比稀释，最小浓度为1×100Copes /μL。 进行普通PCR、巢式PCR和荧光定量PCR 扩增，比较3 种方法的灵敏度。

1.9 临床样本的检测试验 应用普通PCR、巢式PCR 和荧光定量PCR 分别对采自吉林省珲春地区的86 份血液样品进行检测，比较3 种PCR 方法的阳性检出率。

2 结果

2.1 不同PCR 特异性试验 特异性试验结果显示，仅牛卵形巴贝斯虫DNA 样本扩增后出现特异性DNA 条带，而牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫均未扩增目的条带(见图1、图2)。

图1 巢式PCR(A)和普通PCR(B)特异性试验结果

图2 荧光定量PCR 特异性试验结果

2.2 不同PCR 的灵敏度检测结果 将质粒DNA模板按10 倍倍比稀释成1 ×107～1 ×100Copies/μL，巢式PCR 灵敏度最高，普通PCR 灵敏度最低，结果见图3，图4。

图3 普通PCR(A)和巢式PCR(B)灵敏度检测结果

图4 荧光定量PCR 灵敏度检测结果

2.3 不同PCR 临床样本检测 分别应用血涂片镜检、普通PCR、巢式PCR 和荧光定量PCR 对采自吉林省珲春地区86 份血液样本进行检测(见表2)。结果显示，荧光定量PCR 方法更为敏感。

表2 临床样本检测结果

3 讨论

目前，我国对牛卵形巴贝斯虫病的诊断主要通过血液涂片镜检的常规诊断方法确诊本病[6]。 卵形巴贝斯虫传播媒介为长角血蜱，由于长角血蜱也是瑟氏泰勒虫的媒介蜱，因而卵形巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫常混合感染[7]。 PCR 方法具有特异性强、敏感性高的优点是目前该病检测的主要方法。 目前诊断该病PCR 方法主要有普通PCR、巢式PCR 和荧光定量PCR，以上3 种方法对牛卵形巴贝斯虫检测效果比较尚未见报道。

本试验对比了3 种PCR 方法对卵形巴贝斯虫的检测灵敏度和临床样本检出率方面进行比较。结果表明，普通PCR 灵敏度最低，基于18S rRNA基因的巢式PCR 灵敏度是普通PCR 100 倍。 这与简子健等[8]建立巢式PCR 检测环形泰勒虫比普通PCR 灵敏100 倍的结果相一致。 通过对86 份临床样本检测表明，荧光定量PCR ＞巢式PCR ＞普通PCR。 普通PCR 在临床检测中可能出现一些漏检，由于其检测成本较低，适合样本数量较大时临床检测。 荧光定量PCR 适合在普通PCR 检测基础上进行定性分析。 而巢式PCR 操作较为繁琐，易出现假阳性，更适合技术熟练者进行临床检测。

综上所述，普通PCR、巢式PCR 和荧光定量PCR 方法在牛卵形巴贝斯虫检测中都具有一定应用价值，在临床中根据检测目的，选择与之对应的检测方法，可作为血涂片镜检法的有效补充，为牛卵形巴贝斯虫病的诊断提供参考依据。