基于1H-NMR技术寻找非酒精性脂肪肝肝郁脾虚证的差异代谢标志物❋

李若瑜，苗宇船△，苏赵威，贾 飞，李明磊，刘 杨，郭继龙，关 伟，张冉冉，何丽清

(1. 山西中医学院，山西 晋中 030619； 2. 建德市中西医结合医院，浙江 建德 311612)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是遗传-环境-代谢应激相关性疾病。本研究采用核磁共振技术(1H-NMR)分析NAFLD肝郁脾虚证模型大鼠血清中内源性代谢物浓度的变化，以期筛选出与NAFLD肝郁脾虚证相关的代谢标志物，为揭示NAFLD的发病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠16只，体质量200～220 g，北京海淀兴旺实验动物养殖场提供(实验动物合格证号SCKK(京)2014-0013)，常规适应性饲养1周后进行实验。

1.2 主要仪器与试剂

5-羟色胺(5-HT)试剂盒、去甲肾上腺素(NE)试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司；D-木糖排泄率测定试剂盒购自北京奥博星生物技术有限责任公司；600 MHz AVANCE III NMR波谱仪，德国Bruker公司；美国Image-Pro Plus v5.1图像分析管理系统；D2O，购自美国merck试剂公司。

1.3 实验方法

1.3.1 NAFLD肝郁脾虚证动物模型的建立 将实验大鼠按随机数字表法分为对照组和模型组各8只，对照组给予基础饲料喂养，自由饮水；模型组给予高糖高脂饲料+饥饱失常法+慢性束缚应激刺激+夹尾法，建立NAFLD肝郁脾虚证动物模型[1-2]。12周末麻醉采血，常规制备血清，标本储存于-80 ℃冰箱中备用。取肝左叶石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织学变化。

1.3.2 样本预处理 取解冻后血清450 μL，加入D2O350 μL涡旋30 s，于4 ℃ 13000 r/min离心20 min，取上清液600 μL，置于内径5 mm的NMR样品管中备用。

1.3.3 1H-NMR图谱处理 采用 Mest Re Nova 核磁图谱专业处理软件对所有1H-NMR图谱进行傅立叶转换并进行相位、基线调整,以TSP 的化学位移δ 3.04为标准进行化学位移校正。以δ 0.01为单位，对δ 0.01～8.50区域的谱图进行等宽度分割,去除δ 4.67～4.90区域水峰；对图谱进行分段积分,将积分数据归一化处理,使数据集中在 0～1 内用于多元统计分析。

1.4 统计学方法

2 结果与分析

2.1 NAFLD肝郁脾虚证模型复制验证结果

2.1.1 一般行为学特点 模型组大鼠表现为明显厌食，体质量减轻，行动迟缓，弓背静卧，背毛散乱无光泽，粪便溏软。

2.1.2 NAFLD病理组织学结果 图1、2显示，对照组大鼠可见正常肝组织形态；模型组大鼠肝细胞胞质内有大小不等的脂肪空泡,将细胞核挤压至一侧(黑色箭头所示),肝小叶、门管区炎细胞浸润，表明大鼠非酒精性脂肪肝模型复制成功。

表1 各组大鼠GLU、FFA、5-HT、NE、D-木糖排泄率变化比较

注： 与对照组比较：*P<0.05

图1 对照组大鼠肝组织病理切片(HE染色 ×400)

图2 模型组大鼠肝组织病理切片(HE染色 ×400)

2.1.3 肝郁脾虚证指标检测结果 表1显示，与对照组比较模型组血糖、血脂升高，5-HT、NE和D-木糖排泄率显著降低(P<0.05)，成功建立大鼠肝郁脾虚证模型。

图3 大鼠血清1H-NMR图谱注：1.丙酮[2.24(s)]；2.精氨酸[1.72(m)3,25(t)]；3.丙氨酸[1.48(d)3.77(q)]；4.甜菜碱[3.28(s)]；5.肌酐[3.04(s)3.94(s)]；6.α-D-葡萄糖[5.24(d)3.23(t)]；7.β-D-葡萄糖[4.65(d)]；8.二甲基甘氨酸[2.92(s)3.70(s)]；9.3-羟基丁酸[1.20(d)]；10.甘油[3.54(dd)3.66(dd)]；11.糖原[5.39(s)]；12.异亮氨酸[0.99(d)3.65(d)]；13.α-酮戊二酸[2.44(t)]；14.乳酸[1.33(d)、4.12(q)]；15.亮氨酸[0.96(t)]；16.赖氨酸[1.72(m)1.90(m)]；17.肌醇[3.53(d)]；18.N-乙酰糖蛋白[2.05(s)]；19.O-乙酰糖蛋白[2.14(s)]；20.琥珀酸[2.37(s)]；21.苏氨酸[1.33(d)3.58(d)4.24(q)]；22.酪氨酸[6.89(d)]；23.缬氨酸[1.01(d)3.61(d)]

2.2 代谢组学结果

2.2.1 图3显示，1H-NMR图谱的指认与分析 通过大鼠血清1H-NMR图谱，结合HMDB数据库指认出23种代谢产物，各物质对应化学位移与峰型。

2.2.2 多元统计分析 图4、5显示，运用SIMCA-P+ 进行PLS-DA分析得出积分图和S-plot图。图4显示，模型组与对照组明显沿t[1]轴分开，提示组间差异明显，模型R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875，即其中43.6%的变量作为主要成分构造模型，模型的解释率99.9%，模型的预测率87.5%。图5中“S”曲线上的点离原点越远，其VIP值越大，代谢产物差异越明显。由图中可以找到VIP>1差异显著的代谢产物。

2.2.3 寻找差异代谢产物 表2显示，运用SPSS17.0软件对所有代谢物的相对峰面积进行独立样本t检验，差异有统计学意义(P<0.05)者结合S-Plot图的VIP值进行多元统计，得出9种可能是中医证候潜在生物标志物的差异代谢物，并对其相对峰面积的变化进行计算。

图4 大鼠血清1H-NMR下PLS-DA积分图注：PC=3，R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875

图5 大鼠血清1H-NMR下S-plot图注：PC=3，R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875

代谢物化学位移(ppm)变化趋势峰面积对照组模型组丙酮2.24+1.98×10-1±6.50×10-24.12×10-1±1.15×10-1**丙氨酸1.48-7.00×10-1±8.80×10-24.51×10-1±1.22×10-1**甜菜碱3.28+5.30×10-1±1.50×10-11.01×10-0±4.00×10-1*α-D-葡萄糖5.24+6.63×10-1±1.58×10-19.13×10-1±1.07×10-1**甘油3.66+2.12×10-1±2.20×10-23.25×10-1±7.10×10-2**异亮氨酸3.65+1.86×10-1±1.90×10-22.54×10-1±3.70×10-2**α-酮戊二酸2.44+2.15×10-1±4.10×10-23.33×10-1±8.60×10-2**苏氨酸3.58+1.02×10-1±2.00×10-21.41×10-1±2.10×10-2**赖氨酸1.72+1.41×10-1±3.80×10-21.83×10-1±4.30×10-2*

注： 与对照组比较:*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

NAFLD是代谢综合征在肝脏的表现，其基本病理过程是以脂质摄取过多和胰岛素抵抗为首要环节引起脂肪在肝脏细胞储积，涉及能量代谢紊乱和脂质过氧化、免疫应答紊乱等复杂过程。中医认为，肝与脾在生理病理上联系密切，肝主疏泄，脾主升清、运化，疏泄与运化相互为用。肝郁脾虚证的主要病机即肝失疏泄、脾失健运，正对应NAFLD过程中的物质能量代谢紊乱。NAFLD导致肝细胞受损后，肝脏代谢组分的变化可通过检测血液获得[3]，因此对NAFLD肝郁脾虚证的血清代谢组学研究具有重要意义。

模型组血清中甘油与FFA水平升高，可能提示机体内脂肪酸水平升高，而过量的脂肪酸在氧化过程中产生大量ROS，导致肝细胞脂肪变性和坏死。甜菜碱可分解为三甲胺，是脂质代谢的中间产物，其在甘氨酸合成时提供甲基，减轻脂质过氧化作用，增加脂类代谢。模型组中甜菜碱的增多提示脂质代谢增多。

胰岛素抵抗贯穿NAFLD整个过程，最直观的判定特征就是葡萄糖的摄取利用，模型组大鼠血糖明显升高，提示组织对葡萄糖的利用率降低。丙酮是脂肪酸分解时产生的酮类化合物，其含量升高提示能量代谢的过程从葡萄糖利用转为脂肪酸氧化。血清α中-酮戊二酸增加，表明三羧酸循环封闭[4]。

肝脏作为氨基酸代谢的中心，任何肝损伤都可能干扰氨基酸的代谢[5]。肝细胞膜损伤使细胞内蛋白质合成受到抑制，对氨基酸清除率降低，对胰高血糖素的灭活降低，导致内源性蛋白处于高分解状态，释放出大量的氨基酸，使血中氨基酸水平增高[6]。模型组大鼠异亮氨酸水平升高，提示机体启动了支链氨基酸的糖异生作用，以补充机体所需的能量[7]。苏氨酸可与寡糖链结合，对保护肝细胞膜起重要作用，亦能促进磷脂合成和脂肪酸氧化，其水平升高可能是机体对NAFLD产生应激反应的结果，丙氨酸水平下降则与糖尿病等胰岛素抵抗引起的疾病有关。

有研究表明[8]，糖类、脂类、蛋白质的代谢紊乱可能是中医证候的物质基础。本实验测定了血清中9种与NAFLD相关的内源性代谢物含量的变化并进行综合分析，从脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗及氨基酸代谢紊乱等不同方面反映出NAFLD肝郁脾虚证的部分发病机制，有利于确定NAFLD肝郁脾虚证特征性的代谢变化，为证候客观化研究提供了新的方法与思路。

参考文献：

[1] 贾飞,苗宇船,苏赵威,等.逍遥丸对肝郁脾虚证非酒精性脂肪肝病大鼠TLR4表达的影响[J].山西中医,2016,32(3):48-50.

[2] 苏赵威,苗宇船,何丽清,等.当归芍药散加味治疗非酒精性脂肪肝代谢组学研究[J].世界中西医结合杂志,2016,11(2):177-180.

[3] SHI X, WAHLANG B,WEI XL,et al.Metabolomic analysis of the effects of polychlorinated biphenyls in nonalcoholic fatty liver disease[J].J Proteome Res, 2012,11(7):3805-3815.

[4] WEI DD,WANG JS,WANG PR,et al.Toxic effects of chronic low-dose exposure of thioacetamide on rats based on NMR metabolic profiling[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2014,98:334-338.

[5] 张艳花,王东琴,李小伟,等.基于1H-NMR代谢组学技术寻找 CCl4致大鼠急性肝损伤的代谢标志物[J].药物评价研究,2014,37(1):11-16.

[6] 张宁,杨祎楠,刘海洋,等.逍遥散干预肝损伤小鼠的代谢组学研究[J].中成药，2014，36(1):171-175.

[7] 韩晓静,范玛丽,秦雪梅,等.基于代谢组学技术研究黄芩对小鼠代谢的影响[J].中国实验方剂学杂志,2016，22(15):85-91.

[8] 杨宇峰,齐艳文,徐娜,等.脾气虚证代谢综合征大鼠血液代谢组学研究[J].中国中医基础医学杂志,2014,20(8):1056-1058.