去卵巢老年大鼠软骨退变与E2、MMP-13、TNF-α的相关性

KHOO YEW LEE，周 逸 ，张 俐 ，2

（1.福建中医药大学，福建 福州 350122；2.厦门医学院，福建 厦门 361023）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是临床常见的关节病，以关节软骨病变为特征，关节屈伸不利等为临 床 表 现［1］， 其 中 膝 骨 关 节 炎 （knee osteoarthritis，KOA）危害性最大，发病严重时可导致骨关节无法正常运动［2］，致残率高达 53%［3］。 据国内调查统计，KOA患者以年龄55岁居多，60岁以上患者占老年人群里约85%［4-5］，随着年龄递增，发病率越高。前期研究表明：KOA与女性绝经后雌激素水平的改变密切相关，劳损是KOA的重要诱因之一［3］。KOA的女性患者也随着年龄、生理及病理改变而逐年增加［6］。本实验建立6月龄去卵巢鼠劳损性膝骨关节炎模型，模拟临床老年女性膝骨关节炎发生后，探讨 E2、MMP-13、TNF-α 与软骨退变的相关性，为临床防治本病提供依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 6月龄SPF级SD雌性大鼠24只，体质量（438±21）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证书号：SCXK（沪）2012-0002，饲养于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物房，合格证号：2009-0001。

1.2 实验仪器与试剂 石蜡切片机（HM315，美国Thermo公司）；生物组织摊烤片机（YT-7FB，湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）；高速离心机（HC-2514，科大创新股份有限公司中佳分公司）；CAVALLO烤箱 （中山佳威路家用电器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9023A，上海精宏实验设备有限公司）；大鼠跑步台（ZH-PT，淮北正华生物仪器设备有限公司）；TECAN INFINITE M200PRQ多功能型酶标仪（瑞士Tecan公司）；DMI 4000B型生物倒置显微镜（德国Leica公司）。

1.3 实验试剂 硫酸庆大霉素注射液8万U（福州海生福王制药有限公司）；0.9%氯化钠（福州沃森生物技术有限公司）；ELISA大鼠血清 E2试剂盒、ELISA大鼠关节液TNF-α试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；伊红染色液、Cole氏苏木素染色液、正常非免疫山羊血清（北京索莱宝科技有限公司）；即用型免疫组织化学UltraSensitiveTM SP试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；MMP13 Rabbit Polyclonal antibody抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组及模型制备 将24只6月龄SD雌性大鼠按数字表法随机分为对照组、去卵巢组和去卵巢＋跑步组各8只。对照组予常规饲养；去卵巢组行双侧卵巢切除术；去卵巢＋跑步组行双侧卵巢切除术＋大鼠跑台做跑步疲劳训练。双侧卵巢切除术操作方法：每只大鼠按3 mL／kg剂量腹腔注射10%水合氯醛溶液使大鼠麻醉；麻醉后以8%的硫化钠溶液对大鼠剑突至下腹部行脱毛处理；脱毛后，沿前正中线用碘伏消毒，打开腹腔以4号手术线结扎输卵管上段，再去除双侧卵巢及输卵管；术后于腹腔滴入1 mL青霉素（8万U）水溶液，关腹缝合并常规饲养［7］。去卵巢＋跑步组大鼠双侧卵巢切除术后7 d进行跑步疲劳训练，使用大鼠跑步台做跑步疲劳训练，训练设定均度15 m／min，行动物适应性实验期2 d；随后改变均速为30 m／min，间隔5 min，2 次 ／d，上坡坡度为 16°，连续训练 35 d［6］。

2.2 取材 造模5周后，于取材室将大鼠以10%水合氯醛水溶液0.3 mL／100 g行腹腔内麻醉后予以下操作：① 沿腹中线切开腹腔，钝性游离脏器，暴露腹主动脉，以采血针与腹主动脉约15°刺入腹主动脉，再将另一头连接抗凝管，采集腹主动脉血后静置1～2 h，再予离心机以3 000 rmp离心20 min，取血上清液，于－80℃冻存。行腹主动脉抽血后处死大鼠。② 关节液采集：取1 mL注射器1支，抽取超纯水0.1 mL，经髌上囊注入右膝关节腔，充分屈伸活动膝关节；再以l mL注射器再次抽取超纯水0.2 mL，沿髌骨上缘小切口打开关节囊，经切口轻轻灌洗，回抽数次后，充分抽回关节液里的稀释液，转移至EP管，离心机3 000 rmp离心20 min，取上清液，置入液氮箱冷冻保存，再转移至-80℃冰箱冻存。③剥离周围肌肉筋膜组织后，取左侧膝关节固定于4%多聚甲醛，行组织形态学观察。

2.3 检测指标

2.3.1 左侧膝关节HE染色 将雌性大鼠左侧膝关节取下，用4%多聚甲醛固定48 h后续用备制好的脱钙液（10%EDTA）脱钙6周。再以针灸针穿刺膝关节及股骨、胫骨等标本，针刺无明显阻力时即可确定为脱钙成功。脱钙成功后，石蜡包埋组织并切片（6 μm），以苏木素-伊红（HE）染色，采用生物倒置显微镜观察对比3组形态学改变。对其组织结构、细胞形态及潮线的完整性进行膝关节软骨的Mankin 评分及分级［8］：0～2 分为正常软骨，3～5 分为软骨表面纤维化，6～7分为中度软骨损伤，8～10为重度软骨损伤，10分以上为软骨完全缺失。

2.3.2 膝关节MMP-13表达 免疫组化检测标本制备：膝关节石蜡包埋组织并切片（4 μm）后，常规脱蜡至水。以缓冲液洗3 min 2次，降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，再滴加一抗工作液，37℃孵育1～2 h。缓冲液洗 5 min 2次，滴加Primary Antibody Enhancer，在室温下孵育20 min。缓冲液洗 5 min 2次，滴加 HRP Polymer（酶标二抗）后以自来水充分冲洗、苏木素复染、脱水、透明直至封片。并以DMI 6000+型生物倒置显微镜观察MMP-13的表达情况，采用Image-Pro plus 6.0图像分析软件，分析高倍镜下（10×40倍）拍摄的图片并选定单位面积，进行图标定量分析。

2.3.3 血清E2浓度 3组雌性大鼠腹主动脉血充分解冻后，采用酶联免疫竞争法，检测血清中E2浓度。

2.3.4 膝关节液中TNF-α的浓度 关节液充分解冻后，离心机以3 000 rmp，再次离心20 min，吸取上清液，采用酶联免疫竞争法，检测右膝关节液中TNF-α的浓度。

2.4 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布，以（x±s）表示，采用t检验。

3 结 果

3.1 HE染色 对照组软骨中的基质染色均匀，潮线清晰可见，软骨中层细胞无簇集现象且排列整齐，软骨表层光滑无损；去卵巢组软骨表层粗糙，细胞簇集及明显凋亡缺失，潮线变得模糊，软骨基质染色改变；去卵巢+跑步组软骨表层粗糙、皱褶及裂隙，细胞仍有缺失，潮线模糊，软骨基质染色改变，中层细胞开始不同程度地增殖。见图1。

图1 3组大鼠左膝关节软骨HE染色图（×200）

3.2 3组大鼠膝关节软骨Mankin评分比较 见表1。

表1 3组大鼠膝关节软骨Mankin评分比较（x±s） 分

3.3 3组大鼠膝关节MMP-13免疫组化情况比较免疫组化SP技术DAB显色结果：阴性片无表达；对照组MMP-13表达较少；去卵巢组MMP-13表达量增加；去卵巢＋跑步组MMP-13表达量最为显著。见图 2、表 2。

图2 3组大鼠膝关节MMP-13表达免疫组化图（×400）

表2 3组大鼠膝关节MMP-13阳性目标积分光密度值比较（x±s）

3.4 3组大鼠血清中E2、膝关节液TNF-α浓度比较 见表3。

表 3 3组大鼠血清中E2、膝关节液 TNF-α 浓度比较（x±s）pg／mL

4 讨论

绝经后女性骨关节炎的患病率较高，因雌激素的下降可作用于软骨中的炎症因子，参与软骨细胞代谢、基质合成及分解，与女性膝骨关节炎产生关联［6，10］。 研究 绝经后膝骨 关节炎的生理、病理关系中，选用动物模拟模型做实验是较安全的方法。动物造模方法较多［6］，本实验选择了不受任何外界干预而产生膝关节病变的模型［11］进行研究探讨E2、MMP-13、TNF-α 的相关性。

本实验结果显示：与对照组比较，去卵巢组和去卵巢＋跑步组Mankin评分、膝关节MMP-13表达、关节液TNF-α浓度均明显提高（P＜0.01），血清E2浓度明显降低（P＜0.01），且以去卵巢＋跑步组变化最为显著。由此可见，膝关节软骨严重缺损时Mankin评分越高，而血清E2水平则越低，提示E2水平检测结果与Mankin评分两者存在负相关性，E2水平的下降与膝关节软骨损伤及炎症的发生具有共同的发病机理，且存在一定的相关性［12-13］。E2可抑制TNF-α炎性因子的释放，从而减少炎症的发生［14-15］，E2下降则 TNF-α 的浓度升高。 MMP-13是近年来学者研究膝骨关节炎发病机制的重要指标之一，其在膝骨关节炎软骨细胞中存在高表达，是关节软骨退变的主要因素，MMP-13表达的增减与其受损的程度密切相关［16-17］。本实验中去卵巢＋跑步组也存在MMP-13在关节软骨中存在持续高表达状态［18］，证明 E2与MMP-13均参与了关节软骨的完整性、炎症的发生及其退变的过程，提示了雌激素和软骨退化具有一定的相关性，这为绝经老年女性膝关节炎发病的研究提供了实验数据和依据。

参考文献：

［1］ 陈赛楠，黄云梅，陈文列，等.透骨消痛胶囊干预兔膝骨关节炎蛋白多糖与MMP-2、MMP-13表达的实验研究［J］.风湿病与关节炎，2015，4（7）：5-10，60.

［2］ 李芃，张俐.张俐教授治疗中老年女性膝骨关节炎经验［J］.风湿病与关节炎，2014，3（3）：40-42，51.

［3］ 王文胜，陈伟，沈保磊，等.强骨宝对去势大鼠原发性膝骨关节炎关节软骨影响的实验研究［J］.风湿病与关节炎，2016，5（4）：10-13.

［4］ 宋素艳，张晓玲.小针刀疗法治疗膝骨性关节炎疗效观察［J］.陕西中医，2012，33（8）：1071，1100.

［5］ 葛均波，徐永健.内科学［M］.北京：人民卫生出版社，2013：852-854.

［6］ 张俐，李芃，陈凯.去势大鼠劳损性膝骨关节炎新模型的建立［J］.中国中医骨伤科杂志，2014，22（11）：1-3.

［7］ 李芃.强骨宝对疲劳性损伤诱发去势大鼠膝骨关节炎的作用及机制［D］.福州：福建中医药大学，2015.

［8］ MANKIN H J，DORFMAN H，LIPPIELLO L，et al.Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips.II.Correlation of morphology with biochemical and metabolic data ［J］.J Bone Joint Surg Am，1971，53（3）：523-537.

［9］ 郭欣宇，马英，曾艳，等.绝经期骨性关节炎患者血浆性激素和细胞因子水平及其与膝关节功能的相关性［J］.中国全科医学，2008，11（10）：852-854.

［10］王凤翔，董桂芳，王素杰，等.雌激素与绝经后膝骨性关节炎相关分析［J］.慢性病学杂志，2010，12（8）：863，865.

［11］魏星临，刘建宇.上坡运动对去卵巢骨质疏松大鼠股骨及椎体骨密度的影响［J］. 中国老年学杂志，2015，35（15）：4163-4164.

［12］周君，何成奇，郭华，等.兔膝骨关节炎合并骨质疏松症动物模型的建立［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，41（15）：7639-7642.

［13］秦杏坤，柳庆坤，薛会茹，等.亚硫酸盐和雌激素及炎症因子在老年女性膝骨关节炎血清与关节液中的水平及意义［J］.河北医药，2012，34（6）：822-825.

［14］ GANESAN K，TIWARI M，BALACHANDRAN C，et al.Estrogen and testosterone attenuate extracellular matrix loss in collageninduced arthritis in rats ［J］.Calcif TissueInt，2008，83（5）：354-364.

［15］ TINTI L，NICCOLINI S，LAMBOGLIA A，et al.Raloxifene protects cultured human chondrocytes from IL-1β induced damage：a biochemical and morphological study ［J］.Eur J Pharmacol，2011，670（1）：67-73.

［16］ 张超，王旭，姜建元，等.MMP-1、13 mRNA和DDR2表达与关节软骨退变的关系［J］. 复旦学报（医学版），2007，34（1）：126-128.

［17］周君，郭华，夏璐，等.去卵巢对兔膝关节软骨及基质金属蛋白酶-13 表达的影响［J］.中国老年学杂志，2012，32（19）：4235-4237.

［18］唐浚洲，苏楠，周思儒，等.手术诱导的小鼠骨关节炎模型中关节软骨MMP-13表达上调［J］.第三军医大学学报，2014，36（9）：919-922.