大鼠电针后血清对肿瘤坏死因子α诱导凋亡软骨细胞Erk1／2、C-Myc、C-Fos和 C-Jun 基因表达的影响

林 洁 ，吴广文 ，付长龙 ，洪秀娥 ，李 俐 ，林秋祥 ，吴明霞

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；3.福建中医药大学康复医学院，福建 福州 350122）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见老年性多发疾病，发病部位常见于膝关节，表现为疼痛、肿胀、活动受限等，严重影响患者生活质量［1］。OA在中医学上属“痹证”范畴，以肝肾亏虚为病变根本，风寒湿邪是其致痹外因，病机总属本虚标实、本痿标痹［2-3］。电针作为传统针灸疗法与现代电疗结合产物，具有舒经活络、行气活血、消炎镇痛之效，对防治OA具有良好疗效［4-5］。前期研究表明：电针具有抑制软骨细胞凋亡、延缓OA关节软骨退变、促进关节软骨修复的作用［6-8］。本实验拟观察电针刺激大鼠内外膝眼一定时间后获得的血清（电针后血清）对TNFα诱导的大鼠体外软骨细胞凋亡模型的影响，并检测其 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表达情况，从而进一步阐明电针防治OA的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 2月龄SD雄性大鼠30只、4周龄SD雄性大鼠12只购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2012-0002。实验动物饲养于福建中医药大学实验动物中心，使用许可证号：SYXK（闽）2014-0005，分笼饲养，自由饮水，标准饲料喂养。

1.2 实验试剂 磷酸盐缓冲液（PBS）、低糖型DMEM培养基、胎牛血清、二型胶原酶、0.25%胰蛋白酶（美国 Hyclone公司）；肿瘤坏死因子 α（TNFα，美国Sigma 公司）；Annexin V-FITC／PI凋亡试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；逆转录试剂盒（日本TAKARA公司）；PCR引物 （上海铂尚生物技术有限公司）；诺唯赞qPCR SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）。

1.3 实验仪器 华佗牌SD-Ⅱ型电子针疗仪、华佗牌一次性不锈毫针，规格：13 mm×0.25 mm（苏州医疗用品厂有限公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术公司）；CO2培养箱（香港力康生物医疗科技控股有限公司）；相差倒置显微镜、荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；PCR仪 （美国 Applied Biosystems公司）；7500 Fast型荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。

2 实验方法

2.1 血清制备 2月龄SD雄性大鼠30只，应用随机数字表法分为正常组（n＝10）、电针15 min组（n＝10）和电针 30 min 组（n＝10）。 正常组常规饲养，电针15 min组和电针30 min组分别予电针刺激大鼠双侧膝关节内、外膝眼，刺激时间分别为每次15 min、30 min，每天 1次，连续干预 1周。1周后，大鼠在麻醉状态下行腹主动脉采血，经离心获取正常组、电针15 min组和电针30 min组血清，于56℃水浴灭活30 min及过滤除菌后，-20℃保存，细胞实验时用DMEM配制为10%浓度进行干预。

2.2 软骨细胞提取与培养 采用2%戊巴比妥钠麻醉4周龄SD大鼠，每次4只，分3批次提取软骨细胞。用剪刀离断并取出双膝关节，在洁净台上，分离、切取双膝软骨，剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小后，用4 mL 2%Ⅱ型胶原酶于37℃培养箱消化2 h；消化后，收集上清液于15 mL离心管中，以1 000 rpm的速度离心5 min获得软骨细胞；用4 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬软骨细胞沉淀，并接种25 cm3培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。上述步骤重复4次。于倒置显微镜下观察细胞每日生长情况，待细胞长满至85%～90%后传代培养，每隔48 h后更换培养液。以2代软骨细胞为实验对象，调整细胞密度为 1×105个／mL，取 2 mL接种于六孔板中，培养72 h后进行实验。

2.3 软骨细胞干预方法 参考文献［9］，采用10 ng／mL TNFα诱导软骨细胞凋亡。将第2代软骨细胞随机分为正常组、模型组、电针15 min组和电针30 min组。正常组予正常组血清2 mL干预，模型组予含10 ng／mL TNFα正常组血清2 mL干预，电针15 min组予含10 ng／mL TNFα电针15 min组血清2 mL干预，电针 30 min组予含10 ng／mL TNFα电针30 min组血清2 mL干预。各组同时进行干预，干预48 h后检测相应指标。

2.4 检测指标

2.4.1 软骨细胞凋亡率 干预软骨细胞后，用移液枪吸弃培养液，PBS清洗1次，吸弃PBS，用不含EDTA的胰酶消化软骨细胞，收集于流式管中，2 000 rpm离心5 min，调整细胞密度为1～5×105个／mL。流式管每管加入500 μL Binding Buffer重悬软骨细胞，再加入FITC和PI各5 μL，混匀并于室温避光孵育15 min，用流式细胞仪检测各组软骨细胞凋亡率。

2.4.2 软骨细胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表达 如2.3干预软骨细胞后，用Trizol法提取各组软骨细胞总RNA，取1 μg RNA按照TAKARA逆转录试剂盒使用说明书逆转录成cDNA。按照诺唯赞qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒说明书进行操作，以各组cDNA为模板行实时荧光定量PCR检测，β-actin为内参，具体引物序列如下：

表1 引物序列表

实验反应分为三个阶段：预热阶段为95℃3 min； 循环阶段为 95℃ 10 s、60℃ 30 s， 循环 40次；溶解曲线阶段为 95℃ 15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s。实验结束后，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

2.5 统计学处理 采用SPSS 22.0软件统计分析。计量资料属正态分布的以（x±s）表示，采用t检验；不符合正态分布采用非参数检验。

3 实验结果

3.1 软骨细胞形态观察 刚提取的软骨细胞 （即原代软骨细胞）悬浮于培养液中（图1A），原代软骨细胞培养24 h后开始贴壁，培养48 h可见软骨细胞成簇现象（图1B），以梭形或椭圆形生长。细胞数量较多时，可呈典型的“铺路石”状。第1代及第2代软骨细胞状态良好，细胞的增殖速度较快，增殖及分泌基质的能力较强，其中第2代软骨细胞较为纯化，更适合作为实验对象（图1C、图1D）。

3.2 各组软骨细胞凋亡率 电针后血清对TNFα诱导软骨细胞凋亡的影响如图2所示，正常组凋亡率为（6.22±0.13）%，模型组凋亡率为（26.49±0.79）%，2组比较有显著性差异 （P＜0.05）。 电针15 min组凋亡率为（16.81±1.71）%，电针 30 min组凋亡率为（13.88±0.83）%，2组与模型组比较均有显著性差异（P均＜0.05）。

图1 软骨细胞形态观察（×100）

3.3 软骨细胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表达与正常组比较，模型组在 Erk1 ／2、C-Myc、CFos、C-Jun 表达均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，电针 15 min组与电针 30 min组的 Erk1／2、CMyc、C-Fos、C-Jun基因表达均显著降低（P均＜0.05）。 见表 2、图 3。

4 讨 论

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proyein kinases，MAPKs）信号转导通路存在于大多细胞内，

图2 各组软骨细胞凋亡情况

图3 各组软骨细胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun基因表达情况

表 2 各组软骨细胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表达结果（x±s）

其将细胞外刺激转导至细胞及其核内，引起细胞增殖、分化、凋亡等生物学反应。目前，在哺乳类细胞已发现存在着 ERK通路、JNK／SAPK通路、P38 MAPK通路三条并行的MAPKs信号通路。近年来，ERK通路（即Ras-Raf-MEK-ERK信号连级通路）的细胞生物学作用越来越受到重视，有学者认为ERK通路表达上调一方面能促进软骨细胞增殖，形成明显骨赘，另一方面可能会加快软骨细胞凋亡，引起细胞结构破坏、细胞外基质降解［10-11］。该信号通路可被多种细胞外刺激信号激活，激活的Erk1／2进一步促使C-Myc、C-Fos、C-Jun转录因子磷酸化来调节基因表达，进而参与调节细胞增殖、分化和凋亡［12-13］。 相关研究表明：C-Myc、C-Fos、C-Jun 参与多种细胞凋亡活动［14-17］。此外有研究显示：TNFα能激活Ras-Raf-MEK-ERK信号通路，促进IL-1β表达，提高MMPs活性，并与激活产物进一步发生协同作用，促使细胞外基质降解、软骨细胞凋亡［18-20］。

本实验结果显示：TNFα诱导的大鼠凋亡软骨细胞经其电针后血清干预后，细胞凋亡率明显下降，各组软骨细胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 的基因表达显著降低，表明大鼠电针后血清能有效抑制TNFα诱导的软骨细胞凋亡，其机制可能与下调Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因的表达有关。

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