“嗅三针”对阿尔茨海默病小鼠空间记忆能力和海马APP、Aβ蛋白表达的影响*

王 渊，刘智斌，牛文民，王 强，李 杰，鲁 刚

陕西中医药大学(咸阳 712046)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种常见的痴呆症，约占痴呆患者的60%～80%，绝大多数AD患者发病前期无明显征兆，一旦出现进行性认知功能障碍等典型表现时已处于中晚期[1]。研究发现，嗅觉功能障碍是AD早期较为常见的临床表现之一[2-3]，如能在AD早期对嗅觉功能障碍进行干预，将有可能延缓AD发病进程。研究表明，β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein ，Aβ)的沉积和累积所引起的病理级联反应是导致AD的基本病因之一，而Aβ由淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)裂解所产生[4]。“嗅三针”疗法是刘智斌教授多年来治疗痴呆的经验针法，对其具有明显的优势和确切的临床疗效。本研究拟通过切断和保留嗅觉通路，观察嗅三针对AD小鼠空间记忆能力和海马APP、 Aβ蛋白表达的影响，以揭示嗅三针治疗AD的作用机制。

材料与方法

1 动物和分组 采用Morris水迷宫检测，剔除不合格的动物，筛选后选取7个月龄的APP/PS1双转基因小鼠(AD模型小鼠)40只，随机分为4组，同窝阴性小鼠10只作为正常对照组。Ⅰ组(sham)：正常对照组；Ⅱ组(model)：AD模型组；Ⅲ组(XSZ)：嗅三针组；Ⅳ组(XSZ+XSJ)：嗅三针加嗅神经切断组；Ⅴ组(Donepezil )：盐酸多奈哌齐组，每组10只。动物均由南京大学模式动物研究所提供，动物批号：SCXK(宁)2016-003，体重(35.8±4.22)g。

AD模型组、正常组与三个干预组相同时间、相同程度的捉抓刺激，但不做电针刺激；嗅三针组行嗅三针干预；嗅三针加嗅神经切断组在AD小鼠行嗅神经切断术后行嗅三针干预；盐酸多奈哌齐组以3 mg/(kg·d)的剂量，对AD小鼠进行灌胃；以上各组均1次/d，5 d为1个疗程，休息2 d，共进行4个疗程。

2 主要仪器与试剂 韩氏穴位神经刺激仪(型号：HANS-200A型，由南京济生医疗科技有限公司生产)，Morris水迷宫(型号：XR-XM101型，由上海欣软信息科技有限公司生产)，西格玛台式高速离心机(型号：3-16PK型，由德国Sigma公司生产)，电泳仪(型号：NYCP-34ACG型，由北京六一生物科技有限公司生产)，华佗针灸针(规格：0.25 mm×13 mm，由苏州医疗用品有限公司生产)，兔Aβ一抗和兔APP一抗(由武汉博士德生物工程有限公司生产), 山羊抗兔二抗(由辣根过氧化物酶标记，由北京中杉金桥生物技术有限公司生产)。

3 嗅神经切断术模型制作 参照文献[5]对AD小鼠在行嗅神经切断术，采用水合氯醛将AD小鼠进行麻醉，应用立体定位仪将麻醉后的小鼠固定其上，切开小鼠颅顶正中区域的皮肤并小范围分离，以使得其前囟充分暴露，于矢状静脉窦、鼻额缝与眼眶上内侧缘之间钻两个小孔以暴露嗅球，均以1 mm为直径，位于嗅球前端的硬脑膜将其用显微解剖镊提起，对于充分暴露的嗅神经采用锐性切断术，原则上使嗅球不致损伤，对于出血处采用明胶海绵进行压迫，并将青霉素点在伤口处，最后进行伤口缝合。

4 嗅三针干预方法 动物经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后仰卧位放置于预先加热的小动物实验台上。取穴：迎香(双侧)和印堂。迎香(定位)：小鼠鼻孔外侧上端，有毛与无毛交界处；印堂(定位)：小鼠两眼眶上缘中点连线与正中线交点[6]。操作方法：采用0.25mm×13mm寸毫针，对于迎香采用斜刺法，进针深度为2 mm，方向朝向内上方，对于印堂采用平刺法，进针深度为2 mm，方向朝向鼻根部；对于印堂将电针的正极接于其上，对于一侧迎香将电针的负极接于其上，刺激时间为10 min，之后将电针的负极换接于另侧迎香上，刺激时间为10 min。刺激参数：疏密波，频率为2/15HZ，强度为1 mA。

5 Morris水迷宫空间探索实验 空间探索实验：于干预治疗的最后一天，在Morris水迷宫环境、池水温度、定位航行试验不发生变化的条件下，去除水迷宫下的站台，然后将小鼠放置于第3象限面壁池内，用电脑记录并分析小鼠60 s内所经过的游泳路线，清理小鼠身上水渍，放入鼠笼。其他象限的实验则无需再进行。通过记录小鼠第3象限时间占总时间的百分比以及穿越平台次数，评估小鼠的空间记忆能力。

6 免疫蛋白印迹(Western blot)法检测海马水平APP蛋白、Aβ蛋白表达 实验结束后，将小鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉后，快速取海马组织，装入EP管后迅速放入液氮，移入-80度保存备用。WB检测步骤如下：将海马(等量大小)样本剪取后，放置于EP管中，将RIPA蛋白裂解液(等体积预冷)加入到每份等量的海马样本中，采用超声破碎仪对其研磨，高速冷冻离心机4 ℃、1500 r/min离心。对于各样本的蛋白浓度的测定，采用BCA蛋白定量试剂盒对其进行检测，蛋白上样量的剂量经确定约30 μg，并将5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液加入其中。对于目标蛋白，将其上样后，再进行为时1 h的电泳，然后转膜至PVDF膜上，封闭， 再加入一抗兔抗鼠APP(1∶100)和Aβ(1∶100)，4 ℃孵育过夜。然后经二抗HRP-羊抗兔IgG(1∶100)，常温下孵育1 h，TBST洗涤，使用ECL试剂盒显影5 min，将目标蛋白曝光完毕后，应用凝胶成像分析系统计算目标条带灰度值。每个样品重复测量3次，取均值分析。实验以GAPDH作为内参照物。

结 果

1 各组小鼠空间探索实验穿越平台次数 见表1。通过单因素方差分析，其结果显示：通过空间探索实验，在对靶象限(第三象限)的观察统计中得出，五组小鼠在实验中穿越平台的次数分别为：空白组1.82次，模型组0.71次，嗅三针组1.41次，嗅三针加嗅神经切断组0.76次，盐酸多奈哌齐组1.53次。嗅三针组在靶象限(第三象限)穿台次数成绩居中，高于模型组，低于空白对照组。

表1 各组小鼠空间探索实验穿越平台次数比较

注：与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

2 各组小鼠空间探索实验靶象限时间占总时间百分比 见表2。通过单因素方差分析，其结果显示：通过空间探索实验，在对靶象限(第三象限)所占总时间(60 s)的百分比观察统计中得出，五组小鼠在靶象限的时间分别为：空白组49.12%，模型组23.53%，嗅三针组39.54%，盐酸多奈哌齐组37.13%，嗅三针加嗅神经切断组19.97%。五组比较结果显示嗅三针组成绩最好。

表2 各组小鼠空间探索实验靶象限时间

注：与空白组比较， *P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

3 各组小鼠海马APP、 Aβ蛋白表达 见图1、2，表3、4。通过对大鼠海马区APP蛋白、Aβ蛋白的检测，经统计学处理，我们发现，对于APP蛋白、Aβ蛋白的表达，与正常对照组比较，AD模型组小鼠的APP蛋白、Aβ蛋白表达显著增高，具有显著性差异(P<0.01)；与AD模型组比较，“嗅三针”干预组小鼠的APP蛋白、Aβ蛋白表达显著降低(P<0.05)；与AD模型组比较，“嗅三针加嗅神经切断组”的APP蛋白、Aβ蛋白表达没有显著性差异(P>0.05)；与AD模型组比较，盐酸多奈哌齐组小鼠的APP蛋白、Aβ蛋白表达显著降低(P<0.05)；嗅三针组与盐酸多奈哌齐组比较无显著性差异(P>0.05)。

图1 各组小鼠海马APP蛋白表达

图2 各组小鼠海马Aβ蛋白表达

组 别n海马APP(比值)空白组1048.35±6.87模型组1082.98±8.12*嗅三针组1056.27±7.52#嗅三针加嗅神经切断组1078.36±6.57盐酸多奈哌齐组1059.56±7.13#

注：与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

表4 各组小鼠海马Aβ蛋白表达

注：与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

讨 论

研究表明，β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein ，Aβ)的沉积和累积所引起的病理级联反应是导致AD的基本病因之一。Aβ沉积导致小胶质细胞(Microglia，MG)在淀粉样斑块周围大量分布并活化,进而激活细胞内信号转导,分泌具有细胞毒性的炎症因子，导致神经元凋亡或死亡，加速AD的发展[7-8]。

嗅觉功能减退是AD早期主要的临床症状之一，且症状持续时间最长[9]，AD的病情具有不可逆性且病程较长，而目前临床上对其中晚期的治疗效果较差，所以为了延缓其病情的进展或预防其发病，早期的干预治疗具有重要意义。“嗅三针”疗法是课题组多年来用于治疗AD和嗅觉功能障碍的一种特色电针疗法[10]，由双侧迎香和印堂三穴配穴组成，二穴功能主治均与嗅觉系统密切相关，故命名为“嗅三针”。前期临床及基础研究应用“嗅三针”方法治疗AD，均取得良好的疗效。有鉴于此，为了进一步明确嗅三针对AD的调控机制，通过影响相关调控环节提高嗅三针疗效延缓AD发展进程，本研究拟通过切断和保留嗅觉通路，观察嗅三针对AD小鼠空间记忆能力和海马APP蛋白、Aβ蛋白表达的影响。

对于小鼠空间记忆能力的评估，我们采用Morris水迷宫测试中的空间探索试验,Morris水迷宫实验是目前应用最广泛并得到国内外学者普遍认可，用来评价动物空间学习记忆能力的行为学实验[11]。研究结果表明：对于空间探索试验各指标，嗅三针组和盐酸多奈哌齐组与空白组比较无显著性差异，与模型组比较有显著性差异，说明嗅三针组和盐酸多奈哌齐组的干预对AD模型小鼠的记忆能力起到了改善作用，但还不能认为嗅三针和盐酸多奈哌齐使AD模型小鼠的记忆能力恢复到正常鼠水平，这可能与小鼠空间搜索策略之间具有一定的相关性，对于空白组小鼠，其在空间平台位置记忆方面表现较好，而当其跨越原平台位置多次后，仍未找到空间平台, 小鼠对其记忆能力开始怀疑并进行其他方式的新探索；嗅三针加嗅神经切断组与模型组比较无显著性差异，说明嗅三针加嗅神经切断组干预后小鼠的记忆能力没有得到改善，提示嗅三针发挥改善AD小鼠记忆能力的作用是基于嗅觉通路完整性的基础之上的。

对于小鼠海马APP蛋白、Aβ蛋白表达，研究结果表明：嗅三针干预组可以显著减少海马区APP蛋白、Aβ蛋白的表达，效应与盐酸多奈哌齐组无显著性差异，说明嗅三针干预AD小鼠的可能作用机制之一是通过减轻小鼠海马区APP蛋白、Aβ蛋白的表达，改善小鼠空间记忆能力；嗅觉神经切断组即使在嗅三针的干预下也并没有减少APP蛋白、Aβ蛋白在嗅神经切断后，干预效应不显现，说明嗅三针通过激活嗅觉通路发挥对APP蛋白、Aβ蛋白的干预效应，且嗅三针干预效应的发挥有赖于嗅觉通路的完整性。

盐酸多奈哌齐是目前临床上对AD有较好治疗效果的药物，且安全性较高[12]，而在本实验研究中，“嗅三针”刺激与盐酸多奈哌齐灌胃干预均能改善AD小鼠空间记忆能力并发挥对海马APP蛋白、Aβ蛋白表达的抑制效应，两者相比，无显著性差异。有鉴于此，我们认为“嗅三针”通过激活嗅觉通路发挥以上干预效应，且其发挥有赖于嗅觉通路的完整性，这可能是嗅三针干预AD小鼠的机制之一，但对其影响嗅觉系统功能的作用机制有待于进一步研究。

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