鸡毒支原体灭活疫苗抗原制备工艺的优化研究

赵玉龙，刘业兵，石 勇，焦玉兰，朱秀同，刘 涛，张新新，尤永君，赵丽霞

（1.瑞普（保定）生物药业有限公司，河北 保定 071000；2.中国兽医药品监察所，北京 100081）

鸡毒支原体病是由鸡毒支原体（MG）引起鸡的一种慢性呼吸道病（CRD）。临床上主要表现为咳嗽、流鼻涕、呼吸时发出罗音等症状，感染鸡群的免疫力受到抑制，引起肉鸡的体重减轻和蛋鸡的产蛋率降低，是危害养鸡业的重要疾病之一。目前对支原体感染的防治主要在于药物治疗、疫苗预防及健康畜群的建立，有效的疫苗免疫是防控该病的重要手段。

目前鸡毒支原体疫苗生产中，主要应用改良Frey氏培养基或其它支原体培养基，所培养的鸡毒支原体菌液（半成品）的浓度一般达到1×108CCU/mL左右，需对半成品进行一定浓缩后方可制备成品疫苗。本研究使用自行改良的鸡毒支原体培养基，提高培养菌液浓度到1×1011CCU/mL；同时使用300KD膜包对菌液进行超滤纯化，去除菌液中杂蛋白含量，降低灭活疫苗发生副反应的概率，提高免疫效果。

1 材料

1.1 培养基

改良 Frey氏培养基按照中国兽药典的方法进行配制；公司改良的鸡毒支原体培养基按照专利配方进行配制，培养基主要成份PPLO肉汤、葡萄糖、酵母浸出物、猪血清、精氨酸等。

1.2 菌 种

鸡毒支原体CR株，由中国兽医药品监察所提供。

1.3 主要试剂

Lowry法蛋白含量检测试剂盒购自Thermo公司；鸡毒支原体ELISA抗体检测试剂盒购自IDEXX公司；300KD膜包（5块）购自Millipore公司。

2 方法

2.1 鸡毒支原体培养

在实验室分别应用改良Frey氏培养基和公司改良培养基，同时接种鸡毒支原体 CR株菌液进行增殖，培养体系3000mL，按照10%接菌量进行传代培养3代，记录每代生长时间和测定的菌液CCU值。CCU测定方法按照中国兽药典的方法进行。

2.2 鸡毒支原体的纯化

取15000 mL鸡毒支原体培养菌液，使用300 KD膜包（5块）先进行第一次10×浓缩至1500mL，补充无菌生理盐水至原体积15000mL；再进行10×浓缩至1500mL，补充无菌生理盐水至原体积15000mL，重复浓缩洗涤3次；收集每次纯化前、10×浓缩渗出液、10×浓缩液和10×浓缩稀释液进行蛋白含量测定和CCU测定。

2.3 制备疫苗及免疫效果评价

同时将纯化和未纯化的鸡毒支原体（菌液浓度均为1×1011CCU/mL）灭活后，按照水油比1：2分别制苗，制备的疫苗免疫3～4周龄SPF鸡，免疫后第3周采血分离血清进行ELISA抗体检测，评价免疫效果。

3 结果

3.1 鸡毒支原体培养

使用Frey改良培养基最终培养产物CCU值达1×108；使用公司改良培养基最终培养产物CCU值达到1×1011，且公司改良培养基增殖速度快于Flury改良培养基3h以上，见表1。

3.2 鸡毒支原体的纯化

以标准品蛋白浓度为纵坐标（μg/mL）、以吸光度OD750值为横坐标做标准曲线，见图1，标准曲线R2值0.9997，符合统计学要求。

通过标准曲线和待检样品的OD值，计算待检样品总蛋白浓度，同时按照CCU测定方法判定样品CCU结果，纯化过程样品总蛋白浓度和CCU测定结果见表2。

鸡毒支原体纯化前CCU值为1×1011，3次10×浓缩液CCU值均为1×1012，3次10×浓缩稀释液CCU值均为1×1011，3次10×浓缩渗出液CCU值均为0，表明使用300 KD膜包经过3次10×浓缩后，鸡毒支原体未见损失。因此判定鸡毒支原体不能通过300KD的膜包滤膜，且在本方法浓缩过程中，鸡毒支原体抗原含量未发生变化。

表1 两种培养基培养效果对比

图1 标准品OD750值与蛋白浓度标准曲线

鸡毒支原体纯化前蛋白浓度为11307.3μg/mL，使用300KD膜包经过一次10×浓缩稀释，蛋白浓度达到6056.4μg/mL，杂蛋白去除率为46.4%；经过2次10×浓缩稀释，蛋白浓度达到2984.7μg/mL，杂蛋白去除率为73.6%；经过3次10×浓缩稀释，蛋白浓度达到2608.3μg/mL，杂蛋白去除率为76.9%。第2次与第3次杂蛋白去除率相差不大，考虑时间因素确定纯化2次综合效果要好。

3.3 免疫效果评价结果

未纯化（总蛋白含量11307.3μg/mL）与纯化2次的鸡毒支原体（总蛋白含量2608.3μg/mL）制苗后免疫SPF鸡，未纯化组免疫后第2～3天部分鸡只精神沉郁、采食下降，纯化组免疫后精神状态良好未见异常；免疫后3周采血检测ELISA抗体水平，纯化组与未纯化组所有血清样品S/P值均大于试剂盒阳性临界值0.5，全部转阳，但是纯化组抗体水平（S/P值）明显高于未纯化组。ELISA抗体检测结果见表3。

4 讨论

鸡毒支原体的生长条件较细菌苛刻，营养要求也较高，目前常用培养基生产的菌液抗原含量不高，菌液浓度低于1×109CCU/mL，需要进行一定倍数的浓缩。我们根据鸡毒支原体生长特点，调整现有培养基的成份和含量，研发出一种改良的鸡毒支原体培养基，实验室培养菌液浓度达到1×1011CCU/mL，显著提升产品质量，降低疫苗生产成本。

表3 疫苗免疫后3周ELISA抗体S/P值检测结果

超滤是借助于超滤膜或其他超滤装置对生物大分子物质进行分离、纯化及浓缩的一种技术，该工艺已用于流感疫苗、口蹄疫、狂犬病毒疫苗等疫苗的纯化和浓缩，并取得了良好抗原浓缩效果和杂蛋白去除效果。本研究采用300KD膜包、2次10×浓缩-稀释的方法对鸡毒支原体培养菌液进行纯化，渗出液CCU测定为0、纯化前后CCU值均为1×1011CCU/mL，鸡毒支原体在纯化过程无渗漏，杂蛋白去除率达73.6%，提高了抗原的纯度，更高效率的纯化方法还需进一步优化试验条件。

由于鸡毒支原体生长条件苛刻，需要添加高浓度血清和多种营养物质，因此制备的疫苗容易引起免疫动物的过敏反应。通过对比纯化和未纯化的抗原制备的疫苗，未纯化组鸡发生应激，而纯化组未见异常，且免疫后3周纯化组抗体水平较高，推测是高纯度的抗原有利于机体产生特异性抗体。

本研究解决了鸡毒支原体灭活疫苗抗原培养菌液滴度低，成本高的难题，从鸡毒支原体抗原生产的培养基和浓缩纯化方法两方面为后续研究提供了一定思路和方法。

表2 纯化过程样品总蛋白浓度和CCU测定结果

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